劉秋菊，王 湘，李蕓芳，黎滿香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

副豬嗜血桿菌外膜蛋白PlpD基因的原核表達(dá)及免疫保護(hù)性分析

劉秋菊，王 湘，李蕓芳，黎滿香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

為研究副豬嗜血桿菌PlpD基因的免疫保護(hù)性，根據(jù)GenBank上已公布的PlpD基因序列設(shè)計(jì)該基因的特異性引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存的副豬嗜血桿菌5型菌株為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-PlpD，并將其轉(zhuǎn)至表達(dá)菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示，在溫度為16℃時(shí)使用終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h，目的蛋白可溶性表達(dá)量最高，Western blot結(jié)果表明該目的蛋白具有較好的反應(yīng)原性。將獲得的融合蛋白PlpD進(jìn)行純化后制備成亞單位疫苗，經(jīng)腹腔注射免疫小鼠，3免后用高于副豬嗜血桿菌的致死劑量1.5×109CFU進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示PlpD基因?qū)π∈缶哂幸欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù)性。

副豬嗜血桿菌；PlpD基因；克隆；表達(dá)；免疫保護(hù)

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， Hps）是一種革蘭氏陰性菌，可引起以纖維性多漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的格氏病［1］。Hps在豬群中很常見，它是仔豬上呼吸道的一個(gè)早期寄居菌，通過伴隨分娩時(shí)與母豬的接觸而獲得［2］，是構(gòu)成豬正常呼吸菌群的成員之一［3］。在健康狀態(tài)下，Hps的定居與免疫之間會(huì)達(dá)成一個(gè)平衡，當(dāng)這種平衡打破后可引起格氏病的發(fā)生［4］。

Kielstein等［5］研究證明Hps血清型至少可分為15種，我國(guó)最為流行的血清型為4型（24.2%）和血清5型（19.2%），除此之外，還有大約25%的分離株無法分型［6］。Cerda-Cuellar等［7］研究發(fā)現(xiàn)在同一豬場(chǎng)中所分離的Hps菌株多樣性及周轉(zhuǎn)量都很高。Hps菌株的多血清型及多樣性給該病的防治帶來了很大的困難，并且不同血清型，甚至同一種血清型的交叉保護(hù)也是多變的，因而更難控制該病的流行［8］。因此，研制出一種能夠針對(duì)多數(shù)血清型或者主要流行血清型的Hps疫苗將對(duì)該病的防治具有重要意義。

外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）是Hps的重要毒力因子之一，在其致病過程中發(fā)揮著重要作用［9］。本研究通過設(shè)計(jì)引物，對(duì)外膜蛋白PlpD進(jìn)行了原核表達(dá)，分析了該蛋白的反應(yīng)原性及免疫保護(hù)性，為之后對(duì)PlpD蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、主要試劑和試驗(yàn)動(dòng)物 Hps血清5型菌株由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定后保存［10］；大腸桿菌BL21（DE3）、DH5α、pET-28a（+）原核表達(dá)載體及Hps血清由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明品系SPF級(jí)雌性小鼠，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；pfu高保真酶、DNA Marker、中分子量預(yù)染蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶SalⅠ以及EcoRⅠ均購自寶物工程有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 Hps-PlpD基因引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中Hps血清5型SH0165菌株序列（登錄號(hào)：CP001321.1），使用Lasergene軟件中的Protean功能挑選出PlpD外膜蛋白并設(shè)計(jì)針對(duì)該蛋白基因的上下游引物，分別在上游引物引入EcoRⅠ位點(diǎn)，下游引物引入SalⅠ位點(diǎn)。PlpD FP∶ GTGAATTCATGAGTA AGGTGTCCGATGAGGGTA； PlpD RP∶ CTGTCGAC TTTATTTAGCTGGATTATATGAAGGAGTTTG。下劃線部分為酶切位點(diǎn)。引物由華大基因有限公司合成。

1.2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 以實(shí)驗(yàn)室保存的Hps血清5型菌株為模板，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為774 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 pET28-PlpD重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性轉(zhuǎn)化子的挑取 將PCR產(chǎn)物用清潔試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-28a（+）均用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切后再次清潔回收，產(chǎn)物用T4連接酶于22℃水浴中連接30 min，隨后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，用Hps PlpD基因的特異性引物篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 pET28-PlpD重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定及序列測(cè)定 將PCR鑒定為陽性的菌落用含有30μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基小量增菌10 mL并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和SalⅠ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。鑒定為陽性的質(zhì)粒送華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序及序列分析，將序列測(cè)定正確的重組質(zhì)粒命名為pET28-PlpD。

1.2.5 PlpD基因的蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28-PlpD轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），挑陽性轉(zhuǎn)化子用Hps PlpD基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。鑒定為陽性的菌落接種于含30μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床以250 r/min培養(yǎng)過夜。菌液按1∶100的比例大量增菌培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6左右時(shí)，加終濃度1mmol/L的IPTG，37℃搖床中180 r/min誘導(dǎo)5 h。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的BL21（DE3）作為陰性對(duì)照。

1.2.6 pET28-PlpD表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳及Western blot檢測(cè) 誘導(dǎo)完成后離心收集細(xì)菌，用1/20初始菌液體積的1×PBS重懸，然后置于冰水混合物上進(jìn)行超聲裂解，4℃、10 800×g離心5 min，分別收集上清和沉淀。沉淀用等量的1×PBS重懸，用2×SDS蛋白上樣Buffer處理樣品，最后將處理好的上清、沉淀以及陰性對(duì)照樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。最后用Western blot方法檢測(cè)蛋白的反應(yīng)原性。

1.2.7 PlpD重組蛋白純化 將細(xì)菌超聲裂解后低溫離心，取上清利用鎳離子柱親和層析方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化，上樣后用3倍介質(zhì)體積的30 mmol/L咪唑洗滌吸附的雜蛋白，再用3倍介質(zhì)體積的500 mmol/L咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.8 PlpD重組蛋白免疫保護(hù)性分析 測(cè)定純化后PlpD重組蛋白的濃度，加入氫氧化鋁佐劑配制疫苗，采用皮下注射的方式以50 μg/只的劑量免疫6只4周齡左右的雌性昆明小鼠，每隔15 d免疫1次，共免疫3次，并設(shè)置兩個(gè)對(duì)照組，分別注射等劑量的生理鹽水及商品化疫苗。3免后d3對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，以高于Hps致死劑量1.5×109CFU腹腔注射小鼠，觀察并記錄1周內(nèi)小鼠的健康狀況。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增PlpD基因 以保存的Hps血清5型菌株為模板，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，最終得到1條與預(yù)期目的片段大小相符的特異性條帶，約為774 bp（圖1）。

圖1 PlpD基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR product of PlpD gene

2.2 pET28-PlpD重組質(zhì)粒測(cè)序及酶切鑒定 pET28-

PlpD重組質(zhì)粒用EcoR I和Sal I雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到兩條大小與預(yù)期相符的片段（圖2），結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。pET28-PlpD重組質(zhì)粒測(cè)序的結(jié)果與GenBank中發(fā)表的Hps血清5型序列的同源性高達(dá)98%以上。

圖2 pET28-PlpD重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28-PlpD by enzyme digestion

2.3 PlpD重組蛋白的SDS-PAGE鑒定及Western blot分析 重組表達(dá)菌經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，有特異性目的蛋白的表達(dá)，大小約為29 kDa，與預(yù)期一致。在16℃誘導(dǎo)12 h時(shí)，目的蛋白實(shí)現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，該目的蛋白能與Hps的陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有一定的反應(yīng)原性（圖3）。

2.4 PlpD重組蛋白純化 使用鎳離子柱親和層析的方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，獲得較純的目的條帶（圖4）。

2.5 PlpD重組蛋白免疫保護(hù)性分析 對(duì)3免后的小鼠以高于Hps的致死劑量攻毒后6 h，小鼠均開始呈現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)出扎堆、精神萎靡。隨著病程的延長(zhǎng)逐漸表現(xiàn)為顫栗、食欲不振，無飲欲，眼角分泌物增多，呼吸頻率加快并且呈現(xiàn)出典型的腹式呼吸，隨后呼吸頻率逐漸減慢、減弱。最后實(shí)驗(yàn)組中4只小鼠出現(xiàn)強(qiáng)烈的全身抽搐、痙攣并陸續(xù)死亡，2只小鼠于攻毒后36 h開始恢復(fù)正常并存活下來，兩個(gè)對(duì)照組中小鼠全部死亡（表1）。

圖3 PlpD重組蛋白SDS-PAGE電泳和Western blot分析Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of the recombinant PlpD protein

表1 小鼠保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The immune protective effect of recombinant PlpD protein against Hps for mice

3 討論

以Hps為病原的格氏病在我國(guó)流行較為廣泛，給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大的損失。由于Hps血清型多，菌株之間毒力差異大等特點(diǎn)，目前并沒有適應(yīng)面較廣的疫苗對(duì)其進(jìn)行有效防控。為此，本研究對(duì)該細(xì)菌的一種潛在的具有抗原保護(hù)性的外膜蛋白進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并對(duì)其抗原反應(yīng)性進(jìn)行初步分析，以期能為新型疫苗的研究和開發(fā)提供依據(jù)。

圖4 PlpD重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purifi ed PlpD recombinant protein

本研究使用PCR方法擴(kuò)增得到PlpD基因的目的片段，并將其插入到pET-28 a（+）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，最終將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并分析其抗原反應(yīng)性及免疫保護(hù)性。最初，將PlpD全長(zhǎng)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，結(jié)果未能獲得目的蛋白。隨后對(duì)該蛋白使用在線軟件SinaIP 4.1 Server（http∶//www.cbs.dtu.dk/services-/SignalP/）預(yù)測(cè)其疏水區(qū)域以及信號(hào)肽區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白雖沒有信號(hào)肽區(qū)域，但是在PlpD蛋白氨基酸序列N端有一段長(zhǎng)為24個(gè)氨基酸的疏水區(qū)域，這可能是該蛋白無法表達(dá)的原因。通過設(shè)計(jì)引物，將編碼該疏水區(qū)域的24個(gè)氨基酸基因序列去掉，重新構(gòu)建新的pET28-PlpD重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21（DE 3）中再次進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最終獲得大小約為29 kDa的目的蛋白片段。

在對(duì)重組PlpD蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，該重組蛋白在37℃誘導(dǎo)時(shí)以包涵體形式表達(dá)。通過對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間以及IPTG濃度進(jìn)行摸索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度低于25℃時(shí)，可以獲得該重組蛋白的可溶性表達(dá)形式，其中IPTG濃度改變對(duì)其影響不大，最終確定重組PlpD蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為16℃誘導(dǎo)12 h，在此條件下，目的蛋白實(shí)現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)。

以高于Hps的致死劑量1.5×109CFU對(duì)3組昆明小鼠進(jìn)行攻毒，其中PlpD重組蛋白免疫小組中，攻毒后16 h時(shí)死亡1只小鼠，30～36 h內(nèi)死亡3只，2只發(fā)病后逐漸康復(fù)；商品化疫苗組16 h內(nèi)小鼠全部死亡；注射生理鹽水組12 h內(nèi)死亡2只，14～16 h死亡3只，17 h死亡1只。商品化疫苗組全部死亡的可能原因有如下幾點(diǎn)，其一，該商品化疫苗使用的是油性佐劑，皮下注射小鼠后會(huì)在局部形成包塊，在一定程度上影響了小鼠的生長(zhǎng)，因此該組小鼠的平均體重始終低于其他小組，致使小鼠的自身免疫力下降；其二，該商品化疫苗所使用的菌株為不同的亞型；其三，本研究中所攻毒的劑量過高，該商品化疫苗免疫后對(duì)小鼠產(chǎn)生的保護(hù)力不夠。

由結(jié)果可知，注射PlpD重組蛋白免疫小組相對(duì)于另外兩組發(fā)病時(shí)間及死亡時(shí)間均較晚，存活率為33.3%，可見，Hps的外膜蛋白PlpD具有一定的抗原保護(hù)性，但在本研究中未與其他外膜蛋白的保護(hù)性進(jìn)行比較，PlpD重組蛋白對(duì)不同Hps血清型交叉保護(hù)性也有待進(jìn)一步研究。

本研究成功構(gòu)建了PlpD基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，并通過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化使得重組PlpD蛋白獲得高效可溶性表達(dá)，Western blot檢測(cè)顯示該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，小鼠的保護(hù)性試驗(yàn)證明該重組蛋白具有一定的免疫保護(hù)性。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND IMMUNE PROTECTION OF OUTER MEMBRANE PROTEIN PLPD OF HAEMOPHILUS PARASUIS

LIU Qiu-ju， WANG Xiang， LI Yun-fang， LI Man-xiang
（College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

In order to study the immune protection of PlpD of Haemophilus parasuis（Hps）， specifi c primers were designed according to the published information and the genomic sequence of serotype type 5 of Hps kept in our laboratory was used as template for PCR amplifi cation. Subsequently， the recombinant expression plasmid was constructed and transformed into E. coli BL21（DE3） for expression of PlpD protein. After induction with 1mmol/L IPTG for 12 h at 16℃， the recombinant PlpD protein was expressed abundantly as detected in SDS-PAGE. Western blot analysis showed that the expressed protein had good immunoreactivity. The recombinant PlpD was purifi ed for preparation of subunit vaccine that was used to intraperitoneally immunize mice three times. The immunized mice were then challenged with 1.5×109CFU of Hps and some degree of protection was observed.

Haemophilus parasuis； PlpD gene； cloning； expression； immunoreactivity

S852.61

A

1674-6422（2015）05-0053-05

2015-07-15

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015NK3017）

劉秋菊，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

黎滿香，E-mail：manxiangl@163.com