宋凱杰，陳宗艷，黃云秀，3，李傳峰，孟春春，李丹丹，張淼濤，劉光清

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；3. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

鴨TLR3基因胞外區(qū)的原核表達(dá)及抗體制備

宋凱杰1，2，陳宗艷1，黃云秀1，3，李傳峰1，孟春春1，李丹丹1，2，張淼濤2，劉光清1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；3. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

采用PCR方法擴增鴨TLR3基因胞外區(qū)，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)重組TLR3蛋白，并從包涵體中純化重組蛋白。結(jié)果顯示，PCR擴增得到972 bp的TLR3基因胞外區(qū)，用純化的重組TLR3蛋白免疫實驗兔，制備TLR3的多克隆抗體，用Western blot和ELISA檢測其特異性及效價。本研究成功表達(dá)了TLR3基因胞外區(qū)，用該蛋白免疫實驗兔后，制備的多抗能與TLR3特異性反應(yīng)。

TLR3；胞外區(qū)；原核表達(dá)；多克隆抗體

天然免疫系統(tǒng)是機體抵御外來病原體的第一道防線。宿主細(xì)胞表達(dá)多種多樣模式識別受體（pattern recognition receptor， PRR）來感受病毒的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），包括識別病原體的脂質(zhì)、脂蛋白、蛋白和核酸。PRR識別PAMP后激活胞內(nèi)的信號通路，最終引起細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子、趨化因子、干擾素和一些共刺激分子的上調(diào)［1］。Toll樣受體屬于Ⅰ型跨膜蛋白，胞外的亮氨酸富含區(qū)域負(fù)責(zé)識別病原體的PAMP，胞質(zhì)區(qū)與IL-1受體同源，稱為TIR區(qū)，負(fù)責(zé)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］。隨著對水禽類Toll樣受體的不斷深入研究，在鴨中已有6種Toll樣受體被發(fā)現(xiàn)，包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR7［3-7］。其中TLR3負(fù)責(zé)識別雙鏈RNA，通過TRIF接頭蛋白激活I(lǐng)KKε和TBK1激酶，這些激酶活化IRF3和IRF7后，促使核轉(zhuǎn)錄因子NF-ΚB轉(zhuǎn)位和誘導(dǎo)IFN-α、IFN-β、細(xì)胞因子的產(chǎn)生，起到抗病毒作用［8］。

研究發(fā)現(xiàn)，番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）感染番鴨后，TLR3、IFN-α、IFN-β的表達(dá)量隨著感染天數(shù)增加先上升后下降，這說明TLR3對雙鏈RNA病毒產(chǎn)生了應(yīng)答，從而證實TLR3參與番鴨抵抗MDRV感染反應(yīng)［9］。北京鴨與番鴨同屬于鴨科，番鴨屬于棲鴨屬（Cairina）的疣鼻棲鴨（Cairina moschata）家族，而北京鴨屬于綠頭鴨屬（Anas platyrhynchos），番鴨的TLR3基因結(jié)構(gòu)及功能已有報道［4］，而有關(guān)北京鴨的TLR3基因功能研究甚少。對北京鴨TLR3基因結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，對于解析鴨重要疾病的發(fā)生傳播機制及機體免疫應(yīng)答具有重要意義，同時也可以豐富鴨科天然免疫受體庫的研究。本研究在從北京鴨外周血單個核細(xì)胞中成功擴增出TLR3基因基礎(chǔ)上，表達(dá)了TLR3胞外區(qū)，并制備了其特異性多克隆抗體，為研究TLR3功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 Trans5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；重組質(zhì)粒pEASY-Blunt5-TLR3由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所劉光清課題組構(gòu)建并且保存［10］；pET-32a（+）載體購自Novagen公司。

1.2 主要試劑 PFU高保真酶購自Tiangen公司；T4連接酶購自Promega公司；BamHⅠ 和XhoⅠ 限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司（大連）；二氨基聯(lián)苯胺顯色色液購自武漢博士德公司；抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體購自北京康為世紀(jì)公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自中杉金橋公司（北京）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自購自BioTake公司。

1.3 TLR3基因的擴增 根據(jù)GenBank中北京鴨TLR3基因序列（登錄號：KM434239）設(shè)計擴增胞外區(qū)基因的引物。TLR3-F：5'- cgGGATCCtctaactgcaacataaac-3'（下劃線核苷酸為BamHⅠ識別位點）； TLR3-R：5'- ccCTCGAGagtagtgatcataaacag-3'（下劃線核苷酸為XhoⅠ 識別位點），預(yù)期擴增產(chǎn)物長度為972 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。以本實驗室之前構(gòu)建的pEASY-Blunt5-TLR3質(zhì)粒為模板，用2× pfu DNA聚合酶擴增TLR3基因，PCR反應(yīng)體系：模板DNA（200 ng/μL）0.1 μL，pfu Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/uL）各1 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。同時設(shè)立陰性對照，不加模板。取PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，切膠并用BioTake公司凝膠回收試劑盒純化回收。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將純化的TLR3基因和pET-32a（+）載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后用T4 DNA連接酶連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐抗性的平板篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定后，交由上海美吉生物公司測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a/TLR3。

1.5 TLR3基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-32a/TLR3轉(zhuǎn)化至E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐抗性篩選后，挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至OD600為0.8時，加入IPTG（終濃度為1.0 mmol/L）誘導(dǎo)后，分別于培養(yǎng)2、4、6、8、10 h后收集菌液1 mL，4℃、1000×g離心5 min，收集菌體沉淀，取合適菌量與5倍濃度上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.6 TLR3融合蛋白的純化 小量收集鑒定菌液培養(yǎng)，稱量菌體濕重，每克菌體加入3mL細(xì)胞裂解緩沖液Ⅰ，輕輕用玻璃棒使菌體懸起，每克濕重加入4 μL 100 mmol/L PMSF和80 μL 10 mg/mL溶菌酶，37℃攪動20 min，超聲破碎直至不粘稠，超聲波工作電壓400 V，工作5 s，間隔5 s，于4℃、10 800×g離心10 min，分別取上清和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以確定TLR3的表達(dá)形式。之后，擴大培養(yǎng)表達(dá)TLR3的重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)TLR3蛋白。參照分子克隆實驗指南［11］，從包涵體中純化蛋白，對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定，使用的一抗為抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體。

1.7 抗TLR3多克隆抗體的制備 健康新西蘭大白兔飼養(yǎng)1w后進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為1 mg純化后的重組蛋白，與等體積弗氏完全佐劑完全乳化后皮下多點注射。2周后進(jìn)行第2次免疫，免疫劑量為1 mg純化后的重組蛋白，與等體積弗氏不完全佐劑完全乳化后皮下多點注射。此后每隔1周免疫1次，劑量與方法同第2次免疫。第4次免疫后于d5耳緣靜脈采血，檢測抗體效價?？贵w效價達(dá)到一定數(shù)值后進(jìn)行加強免疫，免疫劑量為1 mg純化后的重組蛋白，耳緣靜脈注射。加強免疫后d7，頸動脈采血，離心制備血清，分裝后于-20℃保存

1.8 間接ELISA方法測定多克隆抗體效價 重組的蛋白包被ELISA板（1 μg/孔），4℃過夜，用5%脫脂乳37℃封閉2 h；PBST洗滌3次。將兔抗TLR3多克隆抗體按照倍比法用PBS稀釋（按1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12 800的比例稀釋，每個稀釋度設(shè)立3個復(fù)孔），37℃ 孵育1 h；PBST洗滌3次，以羊抗兔IgG/HRP作為二抗37℃孵育45 min；PBST洗滌3次后，加入TMB避光顯色，最后加濃硫酸終止反應(yīng)；陰性血清按照1∶100稀釋，同時設(shè)立PBS空白對照孔。運用酶標(biāo)儀在波長450 nm處讀取OD450值。各孔OD450和陰性對照孔OD450的比值（P/ N）大于2.1作為確定效價的臨界點。效價以P/N大于2.1的血清最大稀釋倍數(shù)表示。

1.9 Western blot檢測多克隆抗體特異性 第4次免疫后1周，兔心臟采血，分離血清，-80℃分裝后保存。以TLR3融合蛋白為抗原，Western blot檢測多克隆抗體的特異性，待檢血清按照1∶200倍稀釋作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，二氨基聯(lián)苯胺法顯色觀察出帶情況。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 以pEASY-Blunt5-TLR3質(zhì)粒為模板，成功擴增出TLR3胞外區(qū)基因，其長度為972 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將其進(jìn)行雙酶切后，將其插入到pET-32a（+）載體中，得到了pET-32a/ TLR3。進(jìn)一步酶切鑒定和序列測定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含有TLR3基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 TLR3胞外區(qū)蛋白表達(dá)、優(yōu)化及純化 pET-32a/ TLR3轉(zhuǎn)化E.coLi BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，并取不同時間點的重組菌液查看表達(dá)情況，結(jié)果表明誘導(dǎo)4～6 h可使TLR3融合蛋白得到最大表達(dá)。TLR3蛋白為36 kDa，His標(biāo)簽蛋白為19 kDa（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。TLR3蛋白優(yōu)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPTG誘導(dǎo)6 h后，蛋白表達(dá)量達(dá)到最大?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明，在重組菌沉淀和菌體裂解上清液中均能檢測到TLR3重組蛋白，但以沉淀中居多，說明TLR3主要以包涵體形式存在（圖2）。

圖1 鴨TLR3胞外區(qū)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.1 Expression of the extracellular domain of duck TLR3

圖2 鴨TLR3胞外區(qū)重組蛋白的可溶性分析Fig.2 Soluble analysis of the extracellular domain ofduck TLR3

2.3 重組蛋白TLR3多抗的鑒定與效價測定 將純化后的TLR3蛋白分4次免疫實驗兔，得到抗TLR3的高免血清，即多克隆抗體。為了檢測抗體的特異性，將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)印到2份PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件均為：10 V、30 min。一張NC膜使用的一抗為His標(biāo)簽鼠單克隆抗體為（1∶2000稀釋）（圖3A），二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2000稀釋）；另一張NC膜孵育一抗（1∶1000稀釋）為本試驗制備的抗TLR3多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2000稀釋）（圖3B）。Western blot檢測兩張NC膜的結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在約55 kDa處出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶，說明制備的多抗具有反應(yīng)原性。間接ELISA法測定結(jié)果表明，經(jīng)過4次免疫，兔血清抗體效價達(dá)到1∶6400以上，表明原核表達(dá)的重組蛋白可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)（圖4）。

3 討論

圖3 Western blot鑒定重組蛋白結(jié)果Fig. 3 Identifi cation of the extracellular domain of duckTLR3 with Western blot

圖4 兔抗鴨TLR3胞外區(qū)多抗的ELISA效價圖Fig.4 ELISA titer analysis of the polyclonal antibodies against the extracellar domain of duck TLR3

級結(jié)構(gòu)均能被TLR3識別［12］。有報道稱TLR3能夠識別存在于吞噬細(xì)胞內(nèi)病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA［13］。由此可見，TLR3在病毒感染過程中起到了至關(guān)重要的作用。鴨TLR3基因開放閱讀框為2688 bp，編碼895個氨基酸，富含17.0 %亮氨酸，該分子屬于Ⅰ型跨膜受體，運用生物信息預(yù)測軟件［14］發(fā)現(xiàn)其由胞外區(qū)（aa1～aa695）、跨膜區(qū)（aa696～aa718）和胞內(nèi)區(qū)（aa719～aa895）3部分組成，N端含有一個信號肽序列，胞外富含18個亮氨酸重復(fù)序列（leucine rich

對于大多數(shù)病毒來說，包括DNA病毒，在復(fù)制周期內(nèi)會產(chǎn)生雙鏈RNA中間產(chǎn)物，這些RNA的二repeats，LRR），胞內(nèi)含有Toll/IL-1R同源區(qū)結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)負(fù)責(zé)識別病原體，胞內(nèi)TIR區(qū)負(fù)責(zé)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)胞外的亮氨酸富含區(qū)域在識別配體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能方面起重要作用，它們含有一致的基序L（X2）LXL（X2）NXL（X2）L（X7）L（X2），其中X代表任何氨基酸［15］。TIR區(qū)是非常保守的區(qū)域，介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的互作，在動物和植物的胞質(zhì)內(nèi)或胞膜上均被發(fā)現(xiàn)［16］。鴨TLR3蛋白全長難以表達(dá)，出于TLR3蛋白胞外區(qū)負(fù)責(zé)識別病原體的考慮，本研究進(jìn)行了鴨TLR3胞外區(qū)多抗體的制備。將純化的重組蛋白與佐劑混合后，免疫新西蘭大白兔，得到兔抗鴨TLR3多抗，經(jīng)間接ELISA測定多克隆抗體效價為1∶6400；Western blot分析結(jié)果顯示，該抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性。本研究首次制備了鴨TLR3胞外區(qū)片段多抗，具有良好的反應(yīng)性，為后續(xù)研究鴨TLR3蛋白功能提供了良好的技術(shù)材料平臺。

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND ANTIBODY PREPARATION OF THE EXTRACELLULAR DOMAIN OF DUCK TOLL-LIKE RECEPTOR 3

SONG Kai-jie1，2， CHEN Zong-yan1， HUANG Yun-xiu1，3， LI Chuan-feng1， MENG Chun-chun1，LI Dan-dan2， ZHANG Miao-tao2， LIU Guang-qing1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. College of Veterinary Medicine， Northwest A&F University，Yangling 712100， China； 3. College of Animal Sciences and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

To study the function of duck TLR3， prokaryotic expression plasmid of Beijing duck Toll-like receptor 3 （Toll-like receptor 3， TLR3） gene was constructed and expressed in E. coli BL21 （DE3）. The obtained TLR3 protein was purifi ed from inclusion body and its polyclonal antibodies were prepared. The extracellular domain of duck TLR3 gene was amplifi ed with PCR and the resulting 972 bp fragment was cloned into expression vector pET-32a （+）. The recombinant plasmid pET-32a/TLR3 was then transformed into E.coli BL21（DE3） for expression with induction of IPTG. Duck TLR3 protein was purifi ed from the obtained inclusion body. The recombinant protein was used to vaccinate rabbits to prepare polyclonal antibodies. The antiserum samples were collected and examined with Western blot and ELISA， demonstrating its specifi city and reactivity.

Toll-like receptor 3； extracellular domain； prokaryotic expression； polyclonal antibody

S852.42

A

1674-6422（2015）05-0070-05

2015-05-07

上海市科委創(chuàng)新項目（13391901602）；國家自然科學(xué)基金項目（31270194、31101848、31502068）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（201303046）

宋凱杰，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉光清， E-mail：liugq@shvri.ac.cn.；張淼濤，副教授，E-mail：zmt6371@yahoo.com.cn