范國(guó)博，韓先干，張宇曦，2，王少輝，左佳坤，徐 達(dá)，3，于圣青

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；3. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225000）

鴨疫里默氏桿菌pfs基因的克隆表達(dá)及單克隆抗體制備

范國(guó)博1，韓先干1，張宇曦1，2，王少輝1，左佳坤1，徐 達(dá)1，3，于圣青1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；3. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225000）

將鴨疫里默氏桿菌的pfs基因進(jìn)行原核表達(dá)，重組蛋白經(jīng)純化后作為抗原免疫BALB/c小鼠。經(jīng)過(guò)3次免疫后，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，利用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)間接ELISA法測(cè)定腹水效價(jià)、Western blot法檢測(cè)其免疫反應(yīng)性，并鑒定抗體的亞型。重組蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證得到26 kDa Pfs蛋白，免疫小鼠后最終獲得1株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，命名為2E2E6，為IgG1亞類，間接ELISA法檢測(cè)腹水效價(jià)為1：64 000。Western blot結(jié)果表明制備的單克隆抗體具有良好的免疫反應(yīng)性。本研究成功制備了Pfs的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究Pfs在鴨疫里默氏桿菌中的作用提供了參考。

鴨疫里默氏桿菌；Pfs蛋白；單克隆抗體

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎（infectious serositis），是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種急性或慢性接觸性傳染病，可感染鴨、鵝和火雞等禽類，主要侵害1～8周齡的雛鴨，特別是2～3周齡雛鴨最易感［1］。該病自然感染發(fā)病率一般為20%～40%，有的鴨群可高達(dá)70%。發(fā)病鴨死亡率為5%～80%，是造成當(dāng)前養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要傳染病之一。1932年，Hendrison和Hilbert首次分離鑒定RA［2］，1993年Segers等［3］根據(jù)培養(yǎng)特性、16S rRNA序列和表型，明確了其分類地位并建議成立鴨疫里默氏桿菌屬。RA的血清型復(fù)雜，在不同國(guó)家和地區(qū)引起鴨疫里默氏桿菌病流行的血清型不同，目前國(guó)際上公認(rèn)的血清型有21個(gè)［4］。

5'-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（5'-Methylthioadenosine/S- adenosylhomocysteinen ucleosidase，Pfs）對(duì)細(xì)菌具有重要的調(diào)控作用，參與細(xì)菌的甲硫氨酸循環(huán)，可以產(chǎn)生密度感應(yīng)信號(hào)分子AI-2［5］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Pfs對(duì)RA的生物學(xué)特性及AI-2合成能力方面均具有重要作用，然而RA Pfs結(jié)合底物的活性位點(diǎn)尚未可知。本研究通過(guò)克隆表達(dá)純化RA Pfs蛋白，以此作為免疫原成功制備了穩(wěn)定且特異的RA Pfs單克隆抗體1株，并命名為2E2E6，為進(jìn)一步研制RA檢測(cè)試劑盒及Pfs的活性位點(diǎn)的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；重組表達(dá)載體pET28a-Pfs（RA）、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、檢測(cè)用菌種鴨疫里默氏桿菌（Hxb2、Th4、CH1、CH3）、大腸桿菌（DE17、DE47）、沙門氏菌（CVCC1805）和禽巴氏桿菌（CVCC493）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和儀器 RPMI1640和胎牛血清購(gòu)自BIOWEST公司；HAT、HT、SEPPIC ISA206和聚乙二醇均購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗-、異丙醇硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、DAB增強(qiáng)型底物顯色試劑盒、可溶性單組分TMB底物溶液均購(gòu)自天根生化科技有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司；小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP購(gòu)自Southern Biotech公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司。

1.3 鴨疫里默氏桿菌Pfs的表達(dá)及純化 將重組表達(dá)載體pET28a-Pfs（RA）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），37℃培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，裂解緩沖液重懸菌體，超聲破碎裂解，離心后分別收集上清和沉淀并進(jìn)行SDS-PAGE分析，以檢測(cè)重組蛋白Pfs的表達(dá)情況。沉淀經(jīng)0.5% TritonX-100裂解緩沖液溶解，用不同濃度的尿素溶解包涵體，然后通過(guò)SDS-PAGE分析以檢測(cè)重組蛋白Pfs的溶解情況。最后利用His-Binding-Resin親和層析Ni柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，分別用不同濃度的咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫純化，純化后的蛋白利用BCA法測(cè)定其濃度。

1.4 鴨疫里默氏桿菌Pfs蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的制備

1.4.1 動(dòng)物免疫 取6～8周齡BALB/c雌性小鼠，將純化的Pfs重組蛋白透析復(fù)性后濃縮至1 mg/mL，將適量重組蛋白加入等體積的SEPPIC ISA206佐劑進(jìn)行乳化，充分乳化后于小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，按照100 μg/只的劑量；3次免疫后小鼠尾靜脈采血，ELISA檢測(cè)血清的抗體效價(jià)。選擇血清抗體效價(jià)最高的小鼠，腹腔注射不添加佐劑的重組蛋白100 μg，72 h后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4.2 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 通過(guò)方陣滴定法確定間接ELISA法的抗原和抗體的最適濃度，抗原為純化的Pfs重組蛋白，抗體選用小鼠免疫表達(dá)純化的Pfs后制備的陽(yáng)性血清。

用包被液（pH=9.6）將純化的Pfs蛋白稀釋至最適工作濃度，每孔100 μL純化蛋白稀釋液進(jìn)行包被，37℃作用2 h，然后用PBST（含5 ‰Tween-20）洗滌3次并拍干；每孔加入300 μL含5%脫脂乳的PBS封閉液，室溫封閉，PBST洗滌3次并拍干，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 單克隆抗體的制備及篩選 將融合后細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞混合，通過(guò)HAT培養(yǎng)基重懸，以100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)7～10 d，顯微鏡觀察細(xì)胞集落長(zhǎng)至培養(yǎng)孔1/4時(shí)，吸取細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選只能與重組蛋白反應(yīng)但不與表達(dá)載體標(biāo)簽蛋白反應(yīng)的陽(yáng)性克隆，同時(shí)每孔加入200 μL HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)ELISA檢測(cè)后呈陽(yáng)性克隆的細(xì)胞利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆篩選，直至100%陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。

1.5 鴨疫里默氏桿菌Pfs單克抗體的生物學(xué)特性分析

1.5.1 雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性測(cè)定 將雜交瘤細(xì)胞株在相同的操作下連續(xù)傳30代，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定其每代細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)；將雜交瘤細(xì)胞株凍存于液氮中，分別在3、6、12個(gè)月后取出凍存的雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇，擴(kuò)大培養(yǎng)后制備腹水，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)單抗的腹水效價(jià)。

1.5.2 Ig類及亞類測(cè)定 采用小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSysterm/HRP測(cè)定已制備的Pfs單克隆抗體Ig亞類，操作方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.3 單抗腹水的制備及效價(jià)檢測(cè) 將液體石蠟腹腔注射于10周齡BALB/c雌性小鼠，每只0.3 mL，7～10 d后接種篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，腹腔注射，每只5×105PFU/0.2 mL。隨后觀察小鼠腹部狀態(tài)，待腹部出現(xiàn)明顯膨大，即可收集腹水，同時(shí)采用間接ELISA法測(cè)定腹水單抗效價(jià)。

1.5.4 腹水單克隆抗體的Western blot鑒定 對(duì)純化的Pfs蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)印（55 mA電轉(zhuǎn)60 min）將Pfs轉(zhuǎn)印至活化后的PVDF膜上，將膜靜置于PBS封閉液（含有5 mg/ L脫脂乳）中過(guò)夜；PBST洗3次，每次10 min，將腹水1∶10 000稀釋，37℃與PVDF膜作用2 h；PBST洗5次，再用1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫作用1.5 h，PBST徹底洗滌后，加入DAB底物顯色10 min至出現(xiàn)明顯條帶，終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。同法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌和沙門菌與該腹水的特異性反應(yīng)情況。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默氏桿菌Pfs的表達(dá)及純化 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，在26 kDa處可見特異條帶，與預(yù)期一致（圖1），表明在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)融合蛋白His-Pfs。進(jìn)一步分析表明，重組蛋白主要以包涵體形式存在。經(jīng)His-Binding親和純化柱純化后，在150 mmol/L咪唑濃度時(shí)獲得較為純凈的蛋白（圖1），經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得濃度可達(dá)到0.5 mg/mL。

圖1 鴨疫里默氏桿菌Pfs蛋白的原核表達(dá)及純化Fig.1 Expression and purifi cation of Pfs from Riemerella Anatipestifer

2.2 鴨疫里默氏桿菌Pfs蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的制備

間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明小鼠的血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶3200。小鼠腹腔注射不含佐劑的Pfs蛋白100 μg以加強(qiáng)免疫，72 h后取小鼠脾細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)3次亞克隆篩選，最終獲得1株穩(wěn)定分泌鴨疫里默氏桿菌Pfs單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2E2E6。

2.3 單抗腹水的效價(jià)檢測(cè) 制備并收集單克隆抗體腹水，間接ELISA法檢測(cè)腹水單抗效價(jià)，結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株2E2E6的腹水效價(jià)達(dá)到1∶64 000（如圖2）。

圖2 Pfs單克隆抗體腹水ELISA效價(jià)檢測(cè)Fig.2 The ELISA titer of the monoclonal antibody against Pfs in the ascite

2.4 Ig類及亞類測(cè)定 將獲得的Pfs單克隆抗體經(jīng)小鼠單克隆抗體分型試劑盒檢測(cè)，結(jié)果表明細(xì)胞株2E2E6為IgG1亞類，輕鏈為κ鏈。

2.5 腹水單克隆抗體的Western blot鑒定 對(duì)RA 不同血清型的菌株進(jìn)行Western blot檢測(cè)（圖3），結(jié)果表明RA Pfs單克隆抗體2E2E6僅與血清2型Th4株發(fā)生特異性反應(yīng)，與血清1型和10型無(wú)交叉反應(yīng)性。另外，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和禽巴氏桿菌亦無(wú)特異性反應(yīng)，說(shuō)明單克隆抗體2E2E6特異性良好。

3 討論

RA作為危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原之一，血清型較為復(fù)雜，且對(duì)抗生素具有耐藥性，嚴(yán)重制約對(duì)該病的防控。由于RA不同血清型之間無(wú)交叉保護(hù)力或交叉保護(hù)率低，所以對(duì)RA的血清型檢測(cè)工作尤為重要［6］。

圖3 Western blot鑒定Pfs單克隆抗體2E2E6特異性Fig.3 Western blot analysis of the specifi city of MAb 2E2E6against Pfs

本研究選用His標(biāo)簽較小的表達(dá)載體pET28a作為重組蛋白的表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)及純化后獲得了高純度和高活性的免疫原Pfs蛋白，獲得的Pfs單克隆抗體具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性。調(diào)查發(fā)現(xiàn)檢測(cè)RA的分子生物學(xué)方法主要有基于該菌16S rRNA和OmpA的PCR方法［7］，基于莢膜多糖基因序列的Real time PCR［8］以及基于groEL基因的LAMP鴨疫方法［9］等，有報(bào)道指出可利用RA GroEL單克隆抗體檢測(cè)RA的方法［10］。

密度感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌通過(guò)分泌自誘導(dǎo)信號(hào)分子（autoinducer，AI）來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)菌群體密度，并協(xié)調(diào)細(xì)菌生物功能的交流機(jī)制，目前已成為微生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。Pfs在細(xì)菌內(nèi)自體誘導(dǎo)分子合成過(guò)程中是調(diào)節(jié)平衡的關(guān)鍵酶，Pfs抑制劑可抑制自體誘導(dǎo)分子的合成，從而干擾密度感應(yīng)系統(tǒng)，因此Pfs可作為新型抗菌藥物的設(shè)計(jì)方向［11］。Pfs廣泛存在于RA中，且具有一定的保守性，本研究獲得的Pfs單克隆抗體對(duì)血清2型RA具有較強(qiáng)的反應(yīng)特異性，對(duì)血清1型和10型并無(wú)交叉反應(yīng)性，表明所獲得的Pfs單克隆抗體具有良好的反應(yīng)特異性，從而為進(jìn)一步研制鴨疫里默氏桿菌分型檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

研究表明Pfs在合成自體誘導(dǎo)分子和甲硫氨酸代謝中具有重要作用，一方面，SAH在Pfs和LuxS作用下轉(zhuǎn)化為同型半胱氨酸（Hcy），腺嘌呤和信號(hào)分子AI-2；另一方面，MTA由多胺生物合成途徑產(chǎn)生，Pfs可以催化MTA，不可逆水解為腺嘌呤和5-甲硫基-D-核糖（MTR），腺嘌呤被廣泛分布的腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖莖酶回收至腺苷酸庫(kù)中，而MTR則被磷酸化產(chǎn)生5-甲硫基-D-核糖-1-磷酸鹽（MTR-1-P）并轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸［12-14］。Pfs與底物反應(yīng)具有選擇特異性［15］，本研究制備的單抗亦為進(jìn)一步研究Pfs活性位點(diǎn)提供了參考。

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PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO PFS OF RIEMERELLA ANATIPESTIFER

FAN Guo-bo1， HAN Xian-gan1， ZHANG Yu-xi1，2， WANG Shao-hui1， ZUO Jia-kun1，XU Da1，3， YU Sheng-qing1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China； 3. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225000， China）

To prepare the monoclonal antibody against Pfs protein of Riemerella anatipestifer， the recombinant pfs （rpfs） was expressed and purified for immunization of BALB/c mice. After immunization for 3 times， mice were sacrificed for harvest of spleens. The splenocytes from the immunized mice were fused with murine myeloma SP2/0 cells. Positive clones were identifi ed by screening with indirect ELISA and sub-cloned for 3 times. The hybridoma 2E2E6 producing anti-pfs monoclonal antibody （MAb） was obtained. The isotype of this MAb was determined to be IgG1. Ascitic fl uid was titrated to be 1：64 000 in ELISA. In Western blot， MAb 2E2E6 reacted with serotype 2 R.anatipestifer， but not with R.anatipestifer serotypes 1 and 10. The availability of MAb 2E2E6 would be useful for further study of pfs activity.

Riemerella anatipestifer； Pfs； monoclonal antibody

S852.612

A

1674-6422（2015）05-0041-05

2015-06-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31370045、31572546、31272591）

范國(guó)博，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn； 韓先干，E-mail：hanxgan@163.com