富鑫，華家才，儲(chǔ)小軍

（貝因美嬰童食品股份有限公司，配方奶粉研發(fā)中心，浙江杭州310000）

一種發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)快速檢測(cè)技術(shù)的研究

富鑫，華家才，儲(chǔ)小軍

（貝因美嬰童食品股份有限公司，配方奶粉研發(fā)中心，浙江杭州310000）

以還原法為理論基礎(chǔ)，開發(fā)并建立一種應(yīng)用于發(fā)酵乳飲料成品乳酸菌數(shù)指標(biāo)的快速檢測(cè)方法。本方法應(yīng)用儀器記錄了樣品加入反應(yīng)試劑后的顏色變化（RGB），通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，采用斜率法，以R值斜率表示樣品顏色的變化速度。本研究對(duì)發(fā)酵乳樣品進(jìn)行了預(yù)處理，以符合刃天青還原法的反應(yīng)條件。以GB 4789.35《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》為標(biāo)準(zhǔn)，建立了R值斜率與乳酸菌菌落總數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)方程，經(jīng)驗(yàn)證本方法檢測(cè)結(jié)果與GB 4789.35《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法相比，在時(shí)效性、運(yùn)營(yíng)成本等方面具有較大優(yōu)勢(shì)。

還原法；發(fā)酵乳；乳酸菌總數(shù)；快速檢測(cè)

發(fā)酵乳在GB 19302-2010中的定義為以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH降低的產(chǎn)品，涵蓋了發(fā)酵乳、酸乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、風(fēng)味酸乳等產(chǎn)品。由于食用時(shí)發(fā)酵乳及發(fā)酵乳飲料中的活菌數(shù)需達(dá)到一定數(shù)量才能起到保健作用［1］，因此GB 19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中明確規(guī)定了發(fā)酵乳產(chǎn)品的乳酸菌限量：乳酸菌數(shù)≥1×106cfu/g（mL）［2］。由于發(fā)酵乳為全冷鏈運(yùn)輸和銷售，GB 4789.35-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》方法不但需要專業(yè)人員操作，運(yùn)行成本較高，而且48 h的檢驗(yàn)周期，嚴(yán)重縮短了發(fā)酵乳產(chǎn)品原本就很短的貨架期。因此一種快速有效的發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)的檢測(cè)方法，對(duì)縮短出廠檢測(cè)時(shí)間，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)的貨架擺放時(shí)間，進(jìn)而提高企業(yè)利潤(rùn)和產(chǎn)品質(zhì)量有著重要的意義。

本研究以染料還原法為理論基礎(chǔ)。染料還原法是指通過向乳中加入某些氧化還原型染料，根據(jù)染料顏色變化速度來判定乳中細(xì)菌總數(shù)的多少，檢測(cè)染料褪色時(shí)間的方法［3］。原理是氧化還原酶是微生物細(xì)胞內(nèi)在代謝過程中由于生理需要產(chǎn)生主要酶類，在細(xì)胞內(nèi)催化氧化還原反應(yīng)［4］，能將微生物新陳代謝過程中從能量物質(zhì)上脫下的氫傳遞給染料，使其還原并發(fā)生顏色變化。本研究選用刃天青為反應(yīng)試劑，氧化還原酶與刃天青反應(yīng)使刃天青由藍(lán)色變?yōu)樽仙?、粉色直至無色。由于氧化還原酶數(shù)量與乳中存在的細(xì)菌數(shù)量存在一定的線性關(guān)系，因此可根據(jù)生乳的顏色變化可以對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行判定與SPC法有很好的相關(guān)性（r=-0.79）［5］。

本研究采用自主研制的顏色信息采集儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，試圖建立一種快速、準(zhǔn)確的新的檢測(cè)發(fā)酵乳飲料成品乳酸菌數(shù)方法。如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)儀器構(gòu)造Fig.1 Schematic of the experimental instrument

儀器主要由LED發(fā)射器、感應(yīng)器、微處理器等構(gòu)成，采用RGB顏色體系采集信息，記錄檢測(cè)樣品顏色變化。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的相關(guān)研究中，對(duì)刃天青染料還原法的顏色變化對(duì)儀器的RGB顏色體系進(jìn)行Exraction method：principal component analysis（主成分分析），確定以R值斜率為變量，記錄刃天青顏色變化［6］。

乳酸菌并不是微生物學(xué)的分類，是一類能使可發(fā)酵性碳水化合物轉(zhuǎn)化成乳酸的細(xì)菌的總稱［7］。發(fā)酵乳由滅菌后的牛乳接種發(fā)酵劑經(jīng)發(fā)酵制得［8］，因此發(fā)酵乳中的細(xì)菌總數(shù)即為乳酸菌數(shù)。而采用刃天青還原法測(cè)定發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)還需要對(duì)樣品進(jìn)行一些處理。這是由于發(fā)酵乳飲料的pH過低，不符合刃天青染料還原法的反應(yīng)條件。pH對(duì)刃天青還原法的影響主要有兩個(gè)方面：首先，pH是影響細(xì)菌生命代謝活動(dòng)的主要因素，直接影響微生物代謝中的酶反應(yīng)，動(dòng)物酶的適宜反應(yīng)pH在6.5～8.0之間［9］。另一方面，刃天青為氧化還原染料，本身可作為pH指示劑，酸性條件下呈紅色，堿性條件下呈藍(lán)色。當(dāng)氫離子濃度高時(shí)，粉色的試鹵靈濃度增加，溶液顏色將出現(xiàn)明顯變化。當(dāng)氫離子濃度很低，甚至是在堿性條件時(shí)，藍(lán)色的刃天青難以得到氫離子生成試鹵靈，從而變色反應(yīng)收到明顯的限制。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的相關(guān)研究結(jié)果證明，應(yīng)用刃天青染料還原法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)，經(jīng)多重比較大致在pH 6.5～7.0范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果無顯著差異［10］。目前市售的合格發(fā)酵乳pH在4.0～4.5范圍內(nèi)，因此需要將發(fā)酵乳樣品經(jīng)處理后使其pH在6.5～7.0范圍內(nèi)，才能應(yīng)用刃天青染料還原法對(duì)其乳酸菌總數(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)。

以UHT乳對(duì)樣品進(jìn)行稀釋的方法對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行預(yù)處理，使其pH符合刃天青染料還原法的反應(yīng)條件。以儀器記錄結(jié)果及GB 4789.35檢測(cè)結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生乳：黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司提供；發(fā)酵乳：市售；UHT乳：市售；刃天青：Sigma公司；MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；梅特勒-托利多delta320 pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多有限公司；顏色信息采集儀器（自制）：可內(nèi)置20個(gè)比色皿，測(cè)量溫度37℃，CCD傳感器采集樣品顏色信息，每1 min采集一次，連續(xù)10 min，傳輸?shù)接?jì)算機(jī)，檢測(cè)結(jié)果以樣品的三原色值（RGB值）顯示，以Excel表格形式存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理方法

隨機(jī)抽取市售發(fā)酵乳樣品10個(gè)，與UHT乳1∶9混合，pH計(jì)室溫（15℃～20℃條件下）檢測(cè)發(fā)酵乳樣品pH和稀釋后混合液pH。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與驗(yàn)證

本研究隨機(jī)抽取市售樣品17個(gè)，按照1.2.2方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。將預(yù)處理后樣品1 800 μL，加入0.005%（w/v）刃天青溶液200 μL于比色杯中混勻；將比色杯放入自制顏色信息采集儀器中進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)10 min采集樣品RGB顏色信息，以R值斜率表示樣品顏色的變化速度。以乳酸菌數(shù)為縱坐標(biāo)，自制顏色信息采集儀器檢測(cè)結(jié)果（R值斜率）為橫坐標(biāo)，繪制R值斜率與乳酸菌數(shù)之間的關(guān)系曲線，乳酸菌數(shù)為采用GB 4789.35對(duì)未經(jīng)預(yù)處理的樣品中的乳酸菌數(shù)的檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用Excel數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)，分析其相關(guān)性，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另隨機(jī)抽取12個(gè)市售發(fā)酵乳飲料樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證，每組做3個(gè)平行。以X±x形式記錄數(shù)據(jù)，進(jìn)行相關(guān)性分析與t檢驗(yàn)（雙尾）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理方法結(jié)果

樣品預(yù)處理方法結(jié)果見表1。

表1 樣品預(yù)處理后的pHTable 1 pH after sample pretreatment

由表1可以看出，發(fā)酵乳經(jīng)UHT乳10倍稀釋后，pH在6.5～6.9范圍內(nèi)，符合還原法反映條件，因此基于還原法建立發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)的快速方法具有可行性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)17個(gè)市售發(fā)酵乳樣品按照1.2.1方式處理后進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)通過標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以生乳細(xì)菌菌落總數(shù)為縱坐標(biāo)，生乳細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果（R值斜率）為橫坐標(biāo)，繪制R值斜率與菌落總數(shù)之間的關(guān)系曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 R值斜率與乳酸菌數(shù)的關(guān)系曲線Fig.2 Relation between R slope andtotal lactic acid bacteria

本研究最終得到得到回歸方程：y=1.463 7x-4.959 2（R2=0.897 9），式中：y為乳酸菌數(shù)，x為R值斜率。經(jīng)F檢驗(yàn)F=131.950＞F0.05（1.15）=4.54，即本研究方法獲得的R值斜率檢與GB 4789.35方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)關(guān)系極顯著。本研究以此方程作為標(biāo)準(zhǔn)方程，后續(xù)的測(cè)定中將本研究方法得出的R值斜率代入此方程，即可得到乳酸菌數(shù)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的合理性，采集市售發(fā)酵乳樣品，應(yīng)用本研究建立方法檢測(cè)，計(jì)算R值斜率，根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品中的乳酸菌數(shù)，與GB 4789.35方法比較，結(jié)果見表2。

表2 刃天青還原法與GB 4789.35檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of Reduction Reaction Method and GB 4789.35

將表2中刃天青還原法與GB 4789.35方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t-檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 t-檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of t-test

由表3 t-檢驗(yàn)結(jié)果可知，t Stat＜t（雙尾臨界），說明應(yīng)用本研究所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的乳酸菌數(shù)與GB 4789.35方法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著，所以本試驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線較為準(zhǔn)確。

3 討論

1）本研究分析加入試劑后生乳顏色變化，通過斜率法計(jì)算R值斜率，建立了標(biāo)準(zhǔn)方程，實(shí)際測(cè)定中只需將檢測(cè)結(jié)果R值斜率代入此方程，即可得到發(fā)酵乳中的乳酸菌數(shù)。

2）本方法的建立主要依據(jù)GB 19302-2010對(duì)發(fā)酵乳的定義，所以GB 19302-2010涉及的發(fā)酵乳、酸乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、風(fēng)味酸乳等產(chǎn)品乳酸菌指標(biāo)均可應(yīng)用本研究方法判定。

3）由于不同發(fā)酵乳中菌種及其配比不盡相同而導(dǎo)致還原酶含量、活力的差異［11］，引起刃天青還原速度的差異，進(jìn)而影響R值斜率，影響最終檢測(cè)結(jié)果。

4）本研究所采集樣本數(shù)量有限，但證明了建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品顏色變化與發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)的正向相關(guān)趨勢(shì)。更為準(zhǔn)確的，可用于換算R值與乳酸菌數(shù)的數(shù)學(xué)模型，將通過在進(jìn)一步的研究中擴(kuò)大樣本空間以及增大樣本量來得以實(shí)現(xiàn)。

［1］Nathalie Klein，Athena Zouraia，Sylvie Lotal．Probiotic cell counts and acidification in fermented milks supplemented with milk protein hydrolysates［J］.International Dairy Journal，2002，12：853-861

［2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 19302-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：3

［3］ Lemos E G M，Carareto-Alves L M.Short Communication：Resazurin Reducing Time As An Indicator Of Bradyrhizobium Viable Cell Count［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology. 1998，14：139-141

［4］戚中田.微生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：86-87

［5］Garcia A.R.，Prieto M.，Otero A.，et al..Assessment of the microbiological quality of raw ewes milk by rapid colorimetric methods［J］. Netherlands Milk and Dairy Journal，1994，48（2）：99-110

［6］富鑫，管勇佳，田波.生乳細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)儀測(cè)定生乳細(xì)菌總數(shù)的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2012（2）：70-72

［7］江漢湖.食品微生物學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：248-248

［8］張和平.張佳程.乳品工藝學(xué)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007：195-204.

［9］池振明.微生物生態(tài)學(xué)［M］.山東：山東大學(xué)出版社1999：156-157

［10］富鑫.生乳細(xì)菌快速檢測(cè)技術(shù)研究與設(shè)備開發(fā)［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，2011：37-40

［11］武漢大學(xué)生物系微生物學(xué)教研室譯.微生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1987：711-712

Research on a Rapid Detection Technology of Total Lactic Acid Bacteria in Fermented Milk

FU Xin，HUA Jia-cai，CHU Xiao-jun
（BeingmateBaby&Child Food Co.，Ltd.，F(xiàn)ormula R&D Center，Hangzhou 310000，Zhejiang，China）

Based on the theory of REDOX reaction，develop and building a measure which applies to rapid test the total lactic acid bacteria in fermented milk.The method was testing continuously the color（RGB）of the milk samples which had been added reagents by instrument，and the rate of color change was showed as R slope by statistical analysis.This research suggested a method of sample pretreatment in order to fit for reduction reaction conditions As against The Standard Method （GB 4789.35National food safety standardFood microbiological examination：Lactic acid bacteria），a standard curve was established to show the relation between R slope and total plate count.It was no significant difference between the two results of total bacteria measure apparatus and The Standard Method （GB 4789.35National food safety standardFood microbiological examination：Lactic acid bacteria）.Comparing with The Standard Method，this method has some advantages in aspect of lower operating cost and timeliness.

reduction test；fermented milk；total lactic acid bacteria；rapid detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.036

2013-04-10

富鑫（1984—），男（漢），中級(jí)工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品快速檢測(cè)技術(shù)。