楊彬，羅磊，朱文學，康新艷，屈政

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽，471023)

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風熱之功效［1］。金銀花中主要含有揮發(fā)油、有機酸類、黃酮類和三萜皂苷類等化學成分［2－3］，主要功能性成分是以綠原酸為代表的酚酸類和以木犀草苷為代表的黃酮類物質。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有抗菌抗病毒［4］、抗氧化［5－6］、降血脂血糖［7］等作用，木犀草苷具有很強的抗呼吸道合胞體病毒活性［8－9］，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和日用品工業(yè)中。但實際生產(chǎn)中通常以綠原酸的含量來評價金銀花質量［10］，忽略了木犀草苷的作用。2005年版《中國藥典》開始新增了對木犀草苷含量的規(guī)定，木犀草苷也是金銀花質量控制指標之一。

多年來，在關于金銀花有效成分的提取工藝優(yōu)化研究中，基本是以綠原酸含量為考察指標［11－13］，涉及木犀草苷的研究較少。游本剛［14］等人采用正交試驗比較金銀花中綠原酸與木犀草苷的醇提、水提工藝;何小珍［15］等人采用正交試驗優(yōu)化野菊花中綠原酸與木犀草苷的超聲提取條件;Cui［16］等人采用響應面法僅對金銀花中綠原酸的超聲輔助提取進行了優(yōu)化。但運用響應面法同時優(yōu)化金銀花中綠原酸和木犀草苷的提取工藝還未見報道。本實驗采用HPLC法同時測定金銀花中綠原酸與木犀草苷的含量，以兩者得率為指標，通過Box-Behnken Design試驗方案，運用響應面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，得到了綠原酸和木犀草苷得率均高的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花:購于河南封丘縣陳橋金銀花生產(chǎn)基地，品種為豫豐一號。

甲醇、乙醇、H3PO4，均為分析純;色譜純甲醇，超純水、綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110753－201314)、木犀草苷對照品(上海圻明生物科技有限公司，批號MUST-13060908)。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260型高效液相色譜儀(色譜柱:agilent ZORBAX SB-C18反相柱、4.6 mm ×250 mm、5 μm，UV檢測器)，美國安捷倫公司;TGL-18C型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠;塞多利斯200S電子分析天平。

1.3 實驗方法

1.3.1 綠原酸和木犀草苷含量的測定

1.3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品48.3 mg、木犀草苷對照品1.5 mg，分別用甲醇溶解并定容至50 mL，制得質量濃度為966 μg/mL的綠原酸對照品溶液和30 μg/mL的木犀草苷對照品溶液。

1.3.1.2 供試液制備

準確稱取金銀花2 g，按照要求加到50 mL提取溶劑中，在一定溫度下提取一定時間，過濾。重復操作一次，合并濾液并定容至100 mL。量取5 mL提取液，8 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm 微孔過濾膜過濾，HPLC測定提取液中綠原酸和木犀草苷含量。

1.3.1.3 色譜條件［17－19］

流速:1 mL/min;檢測波長:327、350 nm;柱溫:25℃;進樣量10 μL;流動相:A:1%磷酸溶液;B:1%H3PO4-甲醇溶液(體積比=10∶90);梯度洗脫:0～25～30 min，30%～59%～100%B。

1.3.1.4 公式

綠原酸和木犀草苷得率計算公式:

式中:m，根據(jù)標準曲線計算所得綠原酸/木犀草苷的質量(μg);V，提取液體積(mL);m1，金銀花質量(g)。

綠原酸和木犀草苷百分含量計算公式:

式中:Ai，第i次提取樣品中綠原酸/木犀草苷的峰面積(mAU·S);AT，4次提取樣品中綠原酸/木犀草苷的峰面積之和(mAU·S)。

1.3.2 單因素試驗設計

以提取方法、提取次數(shù)、提取時間、料液比、提取溫度、乙醇濃度為試驗因素，以金銀花中綠原酸和木犀草苷得率為試驗指標，分別做單因素試驗，分析各因素對綠原酸和木犀草苷得率的影響。其中，提取方法單因素試驗過程中，共分析了5種提取方法對綠原酸和木犀草苷得率的影響，方法編號見表1。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選擇提取時間(X1)、提取溫度(X2)、醇濃度(X3)、料液比(X4)4個因素進行響應面優(yōu)化試驗。采用Box-Behnken Design進行響應面試驗設計，因素水平編碼如表2。

表1 試驗方法編號表Table 1 Number table of test methods

表2 因素水平編碼表Table 2 Coding of factors and levels

2 結果與分析

2.1 線性關系

精密量取綠原酸對照品 2、4、6、8、10 μL 進樣，以對照品進樣量X(μg)對峰面積Y進行線性擬合，得綠原酸的標準曲線為 Y=3 970.32X－12.75，R=0.999 96，線性區(qū)間為:1.932～9.66 μg。精密量取木犀草苷對照品 2、4、6、8、10 μL 進樣，以對照品進樣量X(μg)對峰面積Y進行線性擬合，得木犀草苷的標準曲線為Y=4 162.93X－2.28，R=0.999 99，線性區(qū)間為:0.06～0.3 μg。綠原酸和木犀草苷的標準曲線如圖1所示。

圖1 綠原酸(A)和木犀草苷(B)的標準曲線Fig.1 The standard curve of Chlorogenic acid and cynaroside chromatographic

按1.3.1.3色譜條件進樣，得到對照品和金銀花供試液色譜圖，見圖2。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取方法對指標的影響

圖2 對照品在327 nm(A)和350 nm(B)的色譜圖和供試液在327 nm(C)和350nnl(D)的色譜圖Fig.2 Chlorogenic acid and cynaroside chromatographic spectrum of standard and examine probational liquid at 327nm and 350 nm

按表1安排試驗，考察不同提取方法對綠原酸和木犀草苷得率的影響，結果見圖3。對比1、2、5號試驗結果可知，醇提法優(yōu)于水提法。這可能是由于綠原酸和木犀草苷在醇溶液中的溶解度更大，易溶于甲醇、乙醇及丙酮等有機溶劑，所以其提取得率更高。且水提過程中，蛋白質、多糖和鞣質等水溶性雜質含量增加［20］，分離、純化等后續(xù)工藝的難度較大。乙醇提比甲醇提的效果好，且乙醇毒性較小，故選乙醇為提取溶劑。對比2和3號、4和5號可知，低溫超聲輔助提取時，綠原酸和木犀草苷的得率較低。這可能是因為，雖然超聲波具有空化作用［21］，能夠加速細胞膜膜壁的破裂，使綠原酸和木犀草苷快速從金銀花中擴散到提取溶劑中，但低溫條件下，綠原酸和木犀草苷在溶劑中的溶解度較小，金銀花中的綠原酸和木犀草苷只有少部分被溶解出來，所以其得率較低，同時也說明提取溫度對兩者得率有重要影響。

圖3 提取方法對綠原酸和木犀草苷得率的影響Fig.3 Effection of extraction method on chlorogenic acid and cynaroside yield

2.2.2 提取次數(shù)的確定

固定料液比1∶25、乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度70℃、提取時間1h，共提取4次，HPLC測定每次提取液中綠原酸和木犀草苷的含量，結果見表3、表4。結果表明，經(jīng)過2次提取，綠原酸和木犀草苷已基本被提取完全，因此提取次數(shù)定為2次。

表3 不同提取次數(shù)綠原酸的含量Table 3 Percent content ofchlorogenic acid in different extraction times

表4 不同提取次數(shù)木犀草苷的百分含量Table 4 Percent content of cynaroside in different extraction times

2.2.3 提取時間對指標的影響

固定料液比1∶25，乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度70℃、提取 2 次，分別于提取 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時取樣，考察不同提取時間對金銀花綠原酸和木犀草苷得率的影響，結果見圖4。由圖4可知，浸提0.5～2 h時，隨著時間的延長，提取液中綠原酸和木犀草苷的含量不斷增加，超過2 h時，綠原酸和木犀草苷的含量基本保持不變。這可能是因為在提取初期，金銀花中的綠原酸和木犀草苷未被完全溶解出來。隨著提取時間的延長，綠原酸和木犀草苷逐漸被全部溶解并擴散到提取溶劑中，直至達到平衡。同時為了縮短周期，選取1、1.5、2 h繼續(xù)對綠原酸和木犀草苷的提取做響應面分析，以確定最佳的提取時間。

圖4 提取時間對綠原酸和木犀草苷得率的影響Fig.4 Effection of extraction time on chlorogenic acid and cynaroside yield

2.2.4 料液比對指標的影響

固定乙醇體積分數(shù)70%、提取溫度70℃、提取時間2 h、提取2次，考察不同浸提時間料液比，對金銀花綠原酸和木犀草苷得率的影響，結果見圖5。由圖5可知，綠原酸和木犀草苷的得率隨料液比的變化基本上呈現(xiàn)相同的變化趨勢，先升高后又下降，但兩者的最適料液比不同。當料液比為1∶15時，綠原酸的得率最高;當料液比為1∶25時，木犀草苷的得率最高。兩者相比，料液比在1∶15～1∶25內，綠原酸得率的變化程度較小。提取溶劑量過少時，金銀花中的綠原酸和木犀草苷提取不完全，故得率較低。提取溶劑過量時，溶劑消耗增加，且增加后序蒸發(fā)濃縮的工作量。綜合考慮，選取料液比 1∶15、1∶20、1∶25 繼續(xù)對綠原酸和木犀草苷的提取做響應面分析，以確定最佳的料液比。

圖5 料液比對綠原酸和木犀草苷得率的影響Fig.5 Effection of liquid-to-material ratio on chlorogenic acid and cynaroside yield

2.2.5 提取溫度對指標的影響

固定料液比1∶25、乙醇體積分數(shù)70%、提取時間2 h、提取2次，考察不同提取溫度對金銀花綠原酸和木犀草苷得率的影響，結果見圖6。由圖6可知，綠原酸和木犀草苷的得率隨溫度的升高不斷增加，當溫度達到70℃時，溫度再升高，綠原酸和木犀草苷的得率降低，但降低程度較小。這可能是由于溫度過高時，綠原酸和木犀草苷的鄰苯酚結構不穩(wěn)定，易氧化或變性，故得率下降［22］，因此提取溫度選擇70℃左右。

圖6 提取溫度對綠原酸和木犀草苷得率的影響Fig.6 Effection of extraction temperature on chlorogenic acid and cynaroside yield

2.2.6 乙醇濃度對指標的影響

固定料液比1∶25、提取溫度70℃、提取時間2 h、提取2次，考察不同乙醇濃度對金銀花綠原酸和木犀草苷得率的影響，結果見圖7。

圖7 乙醇濃度對綠原酸和木犀草苷得率的影響Fig.7 Effection of alcohol concentration on chlorogenic acid and cynaroside yield

由圖7可知，綠原酸和木犀草苷的得率隨乙醇濃度的變化基本上呈現(xiàn)相同的變化趨勢，先升高后又下降，但兩者的最適醇濃度不同。當乙醇體積分數(shù)為70%時，綠原酸的得率最高;當乙醇體積分數(shù)為80%時，木犀草苷的得率最高。這可能是因為，根據(jù)相似相溶原理，綠原酸的極性與70%乙醇溶液的極性相近，木犀草苷的極性與80%乙醇溶液的極性相近［23］，因此在極性相近的溶液中溶解性較好，得率也高。當醇濃度超過最適濃度時，綠原酸和木犀草苷的得率會明顯下降。綜合考慮，選取乙醇濃度60、70、80%繼續(xù)對綠原酸和木犀草苷的提取做響應面分析，以確定最佳的乙醇濃度。

2.3 響應面優(yōu)化

2.3.1 回歸模型的建立與系數(shù)顯著性檢驗

表5 試驗設計與結果Table 5 Experimental design and results

2.3.1.1 綠原酸得率回歸模型的建立與系數(shù)顯著性檢驗

將試驗結果采用Design Expert 7.0.0軟件進行多元回歸擬合，得綠原酸得率對提取時間(X1)、溫度(X2)、醇濃度(X3)和料液比(X4)的二次多項式回歸方程為:

對回歸模型進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結果如下。由表6可以看出，模型顯著性極高，方程不失擬，R2=0.921 9，表明所建立的二次多項式回歸模型成立。對金銀花綠原酸得率影響極顯著，X1X2影響顯著，X1、X4、X1影響不顯著。對金銀花綠原酸得率影響主次關系依次為提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間。

2.3.1.2 木犀草苷得率回歸模型的建立與系數(shù)顯著性檢驗

將試驗結果采用Design Expert 7.0.0軟件進行多元回歸擬合，得木犀草苷得率對提取時間(X1)、溫度(X2)，醇濃度(X3)和料液比(X4)的二次多項式回歸方程為:

對回歸模型進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結果如下。從表7可以看出，模型顯著性極高，方程不失擬，R2=0.918 1，表明所建立的二次多項式回歸模型成立。X2、X3、X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32對金銀花木犀草苷得率影響極顯著，X1X2影響顯著，X1、X1X3、X1X4、X2X3、X42影響不顯著。對金銀花木犀草苷得率影響主次關系依次為乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間。

2.3.2 交互作用分析

將2個因素固定在0水平，經(jīng) Design Expert 7.0.0軟件統(tǒng)計分析，觀察余下2個因素的交互作用。

2.3.2.1 交互作用對綠原酸得率的影響

由表6可知，有4個交互項作用顯著。由圖8可知，在各因素選取的水平范圍內，當提取時間(X1)較短、乙醇濃度(X3)較低、提取溫度(X2)適當、料液比(X4)較高時，綠原酸得率最高。這可能是因為，料液比較大時，不需要高濃度的乙醇，金銀花中的綠原酸就能快速的從原料中溶解并擴散到提取溶劑中。當溫度過高、時間延長時，得率下降，周期延長。提高乙醇濃度時，增加成本，且后序工作難度加大。僅以綠原酸得率為指標時，經(jīng)Design Expert 7.0.0軟件優(yōu)化，得最佳提取工藝條件:提取時間為1h，溫度為72.43℃，乙醇濃度為60.02%，液料比為1∶25。此條 件下綠原酸得率為3.752%。

表6 二次多項式回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance table for quadratic model

表7 二次多項式回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance table for quadratic model

2.3.2.2 交互作用對木犀草苷得率的影響

由表7可知，有3個交互項作用顯著。由圖9可知，在各因素選取的水平范圍內，當乙醇體積分數(shù)(X3)較低、提取時間(X1)和溫度(X2)適當、料液比(X4)較高時，木犀草苷得率最高。這可能是因為與綠原酸相比，木犀草苷的溶解速度較慢，需延長時間才能完全浸提出來。僅以木犀草苷得率為指標時，經(jīng)Design Expert 7.0.0軟件優(yōu)化，得最佳提取工藝條件:提取時間為1.46 h，溫度為69.83℃，乙醇體積分數(shù)為61.56%，液料比為1∶25。此條件下木犀草苷得率為0.068%。

以綠原酸和木犀草苷的得率為指標，經(jīng)Design Expert 7.0.0軟件組合優(yōu)化得到，同時提取金銀花中綠原酸和木犀草苷的最佳工藝條件為提取時間為1.25 h，溫度為70.74℃，乙醇體積分數(shù)為60.14%，料液比為1∶25，在此條件下綠原酸得率為3.703%，木犀草苷得率為0.066%。

2.3.3 驗證試驗

為驗證回歸模型的可靠性，響應面法優(yōu)化金銀花中綠原酸和木犀草苷同時提取工藝的可行性，在模型所得最優(yōu)工藝條件下進行試驗。實際操作中，采用浸提時間為 1.25h，溫度為 71℃，乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶25，3次重復實驗得到的實際值為綠原酸得率為3.741%，木犀草苷得率為0.067%，與理論值偏差較小，重復性好，沒有顯著差異，說明此模型參數(shù)準確可靠。

圖8 交互項對綠原酸得率(Y1)影響的等高線圖和響應面圖Fig.8 Contour plots and response surface showing the effects of interaction terms on yield(Y1)of chlorogenic acid

圖9 交互項對木犀草苷得率(Y2)影響的等高線圖和響應面圖Fig.9 Contour plots and response surface showing the effects of interaction terms on yield(Y2)of cynaroside

3 結論

(1)通過Box-Behnken設計試驗，建立了金銀花中綠原酸和木犀草苷提取工藝參數(shù)的二次多項式回歸模型。方差分析結果表明，該模型準確可靠，可用于金銀花綠原酸和木犀草苷提取得率的預測和分析。

(2)優(yōu)化得到金銀花中綠原酸和木犀草苷的最佳工藝條件為:浸提時間為1.25 h，溫度為71℃，乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶25，此條件下綠原酸得率為3.741%，木犀草苷得率為0.067%。

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