低氧預(yù)處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖和表達(dá)血管生成因子的影響

劉慶娜, 吳補(bǔ)領(lǐng), 陳 婷 , 陳秋月, 賴玲芝

(廣東 廣州 510515: 1. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)

低氧預(yù)處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖和表達(dá)血管生成因子的影響

劉慶娜1,2, 吳補(bǔ)領(lǐng)1,2, 陳 婷1,2, 陳秋月1,2, 賴玲芝1,2

(廣東 廣州 510515: 1. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)

目的: 研究低氧預(yù)處理對(duì)人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)增殖及表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響。方法: 體外分離hDPSCs，按常氧組(210 mL/L O2)和低氧組(30 mL/L O2)分別培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物；MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖；Live/Dead 染色檢測(cè)細(xì)胞活性；qRT- PCR和ELISA檢測(cè)VEGF的表達(dá)量。結(jié)果： hDPSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD29、CD44、CD90表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31表達(dá)均為陰性；低氧組與常氧組均未發(fā)生細(xì)胞壞死現(xiàn)象；低氧組hDPSCs增殖能力和hDPSCs的VEGFmRNA表達(dá)量均顯著高于常氧組(P<0.05); 同時(shí)低氧組hDPSCs 培養(yǎng)上清中VEGF的濃度也顯著高于常氧組(P<0.05)；兩組hDPSCs的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF- 1) mRNA表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但低氧預(yù)處理對(duì)SDF- 1 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。結(jié)論：低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs的細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，并且可顯著促進(jìn)hDPSCs的增殖及VEGF的表達(dá)。

人牙髓干細(xì)胞; 低氧預(yù)處理; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2):68]

人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)是存在于人牙髓組織中的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具備自我更新和多向分化潛能[1]。hDPSCs可從患者拔除的第三磨牙或正畸牙中分離培養(yǎng)獲得，由于其來(lái)源于自體細(xì)胞，可避免免疫排斥反應(yīng)[2]，因而成為牙髓再生研究最適合的種子細(xì)胞。

目前對(duì)hDPSCs的體外培養(yǎng)多采用常氧210 mL/L O2的氧體積分?jǐn)?shù)，然而牙髓干細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境為低氧環(huán)境[3]。同時(shí)大量研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植到體內(nèi)缺血缺氧組織后，多數(shù)細(xì)胞發(fā)生死亡，而低氧預(yù)處理可提高間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的存活率，促進(jìn)血管生成并顯著改善治療效果[4-7]。本實(shí)驗(yàn)擬采用30 mL/L O2的低氧預(yù)處理hDPSCs，研究低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs增殖、細(xì)胞活性及表達(dá)血管生成相關(guān)因子VEGF、SDF- 1的影響，旨在為hDPSCs的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；I型膠原酶、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液 (Sigma，美國(guó))；CD44、CD29、CD90、CD34、CD45、CD31熒光素標(biāo)記鼠抗人抗體(Biolegend，美國(guó))； 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；厭氧微需氧細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(ANOXOMAT MARK Ⅱ，荷蘭)；倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))； LightCycler 480 (Roche，瑞士)；PCR試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)；ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hDPSCs的分離培養(yǎng)

收集臨床16～25歲因正畸或阻生需要拔除的健康完整恒牙，組織塊酶消化法[8]培養(yǎng)hDPSCs。待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%時(shí)，常規(guī)傳代并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hDPSCs表面標(biāo)記物

取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hDPSCs，2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL，重懸于含有1 mg/mL BSA預(yù)冷的PBS，CD29、CD44、CD90、CD34、CD45、CD31抗體冰上避光孵育1 h，1 mg/mL BSA預(yù)冷的PBS清洗，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 低氧培養(yǎng)hDPSCs

取第3～5代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hDPSCs，接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分別放入低氧培養(yǎng)系統(tǒng)(30 mL/L O2)和普通二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(210 mL/L O2)中培養(yǎng)。低氧培養(yǎng)系統(tǒng)氧體積分?jǐn)?shù)從210 mL/L O2降至30 mL/L O2，用時(shí)約2 min，當(dāng)氧體積分?jǐn)?shù)穩(wěn)定至30 mL/L O2后分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.2.4 MTT法檢測(cè)低氧對(duì)hDPSCs增殖的影響

取第3～5代人牙髓干細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3×103/孔)，分常氧組和低氧組進(jìn)行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔)后，每孔加入20 μL MTT( 5 mg/mL)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使顆粒充分溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

1.2.5 細(xì)胞活性檢測(cè)(Live/Dead染色)

低氧和常氧分別培養(yǎng)hDPSCs 24、48、72 h后，去原培養(yǎng)液，加入PI/Calcein- AM混合熒光染色液，PI的終濃度為4 μmol/L，Calcein- AM的終濃度為2 μmol/L，37 ℃孵育15～30 min后，去除染色液，PBS洗滌細(xì)胞1～2次，倒置顯微鏡觀察(死細(xì)胞可被PI染為紅色，活細(xì)胞可被Calcein- AM染為黃綠色)。

1.2.6 qRT- PCR檢測(cè)低氧對(duì)hDPSCs表達(dá)血管生成相關(guān)因子的影響

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)總RNA純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)條件為, 預(yù)變性：95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng): 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；溶解曲線分析: 95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 0 s；降溫：40 ℃ 30 s。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 qRT- PCR各引物序列

1.2.7 ELISA檢測(cè)低氧對(duì)hDPSCs表達(dá)VEGF的影響

取常氧及低氧分別培養(yǎng)24、48、72 h后hDPSCs的上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中VEGF的濃度(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。ELISA檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 hDPSCs的原代培養(yǎng)

倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)約3～5 d后牙髓組織塊邊緣有細(xì)胞游出，多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。約2～3 周可長(zhǎng)滿瓶底80%，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，待細(xì)胞完全貼壁后，每3 d換液1次。平均3 d傳代1次，每次按1 ∶3傳代。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)密度的不斷增加，細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀排列(圖1)。

2.2 hDPSCs表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)所培養(yǎng)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，其中CD29、CD44、CD90(間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物)陽(yáng)性表達(dá)率分別為99.97%、100%、99.92%；CD34、

CD45(造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物)陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.01%、0.47%；CD31(內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物)陽(yáng)性表達(dá)率為0.13%(圖2)。細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物為陽(yáng)性，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物為陰性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞。

a. hDPSCs原代培養(yǎng)第5天 b. 第3代hDPSCs

圖1 倒置顯微鏡觀察(×10)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物

2.3 低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs增殖的影響

低氧培養(yǎng)2 d和3 d時(shí)hDPSCs的增殖活性明顯高于常氧組 (P<0.05)；4 d時(shí)，hDPSCs的增殖活性也高于常氧組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.061)(圖3)。說(shuō)明低氧培養(yǎng)一定時(shí)間可顯著促進(jìn)hDPSCs的增殖。

圖3 低氧對(duì)hDPSCs增殖的影響(*P<0.05)

2.4 細(xì)胞活性檢測(cè)(Live/Dead染色)

Live/Dead染色結(jié)果可見，hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后，低氧組細(xì)胞形態(tài)仍呈長(zhǎng)梭形，與常氧組的細(xì)胞形態(tài)無(wú)差異，兩組細(xì)胞活性良好，均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死的現(xiàn)象(圖4)。

2.5 低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs中VEGF、SDF- 1 mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各時(shí)間點(diǎn)低氧組hDPSCs中VEGF mRNA的表達(dá)量均明顯高于常氧組(P<0.05), 且48 h時(shí)VEGF mRNA的表達(dá)量增加最為顯著。兩組SDF- 1 mRNA表達(dá)量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但3個(gè)時(shí)間點(diǎn)低氧組與常氧組SDF- 1 mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖5)。

2.6 低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs中VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：hDPSCs分別培養(yǎng)24、48、72 h后。各時(shí)間點(diǎn)低氧組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度均高于常氧組。低氧組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度在48 h時(shí)略高于常氧組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；24、72 h時(shí)，低氧組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度顯著高于常氧組(P<0.05)(圖6)。提示低氧預(yù)處理可顯著促進(jìn)hDPSCs分泌合成VEGF。

a、b、c分別為低氧培養(yǎng)24、48、72 h； d、e、f分別為常氧培養(yǎng)24、48、72 h

圖5 低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs表達(dá)血管生成相關(guān)因子的影響(*與常氧組相比P<0.05)

*與常氧組相比P<0.05

3 討論

低氧是體內(nèi)普遍存在的一種生理病理現(xiàn)象，參與胚胎發(fā)育和多種病變的發(fā)展[9]。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)存在的微環(huán)境為低氧環(huán)境[10-11]，牙髓干細(xì)胞作為間充質(zhì)干細(xì)胞，其在體內(nèi)的壁龕同樣是低氧環(huán)境[3]。但目前對(duì)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)多采用常氧環(huán)境培養(yǎng)，這與其在體內(nèi)的存在環(huán)境有著較大的差異，因此采用低氧培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞可更加真實(shí)模擬其體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)大量研究表明低氧預(yù)處理可提高間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的存活率，因此研究低氧環(huán)境下牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性具有重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)采用30 mL/L O2對(duì)hDPSCs進(jìn)行體外低氧預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)仍為長(zhǎng)梭形，與常氧培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)一致，未發(fā)生細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，并且增殖能力顯著提高，與Iida等[12-14]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明短時(shí)間低氧預(yù)處理可促進(jìn)hDPSCs的增殖。血管再生是牙髓再生的一個(gè)重要組成部分，而且血供的及時(shí)建立對(duì)于細(xì)胞移植后的存活有極為重要的意義。有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)hDPSCs可表達(dá)VEGF等血管生成相關(guān)因子，而VEGF在血管發(fā)生和形成過(guò)程中起著中樞性的調(diào)控作用，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、存活和分化為血管，是針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高，促血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的有絲分裂原[17]; 本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致。此外，實(shí)驗(yàn)還對(duì)常氧及低氧培養(yǎng)的hDPSCs表達(dá)SDF- 1進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hDPSCs同樣可表達(dá)SDF- 1。SDF- 1是小分子的細(xì)胞因子，屬于趨化因子蛋白家族，其在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員、歸巢和新生血管形成等過(guò)程中有著重要的調(diào)節(jié)作用。

實(shí)驗(yàn)在進(jìn)一步證實(shí)hDPSCs可表達(dá)血管生成相關(guān)因子VEGF及SDF- 1的基礎(chǔ)上，比較了不同時(shí)間點(diǎn)低氧和常氧培養(yǎng)的hDPSCs表達(dá)血管生成相關(guān)因子的差異，發(fā)現(xiàn)低氧可顯著促進(jìn)其表達(dá)VEGF。低氧48 h時(shí)VEGF mRNA表達(dá)增加最為顯著，低氧24、72 h時(shí)其表達(dá)與常氧培養(yǎng)較接近，ELISA結(jié)果也顯示低氧培養(yǎng)的hDPSCs培養(yǎng)上清中VEGF的濃度顯著高于常氧組，但不同時(shí)間點(diǎn)VEGF的表達(dá)在mRNA水平與蛋白水平存在一定差異，推測(cè)可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。SDF- 1 mRNA的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，但低氧對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響，這與之前的研究結(jié)果有所不同，Gong等[14]采用10 mL/L O2培養(yǎng)牙髓細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)低氧可下調(diào)SDF- 1的表達(dá)，其原因可能是低氧培養(yǎng)的氧濃度不同及低氧培養(yǎng)的時(shí)間不一致引起的。

本結(jié)果顯示低氧可顯著促進(jìn)VEGF的表達(dá)，而大量研究表明VEGF與間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)外促血管生成潛能有著密切關(guān)系。Liu等[18]采用低氧預(yù)處理脂肪干細(xì)胞后，血管生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF表達(dá)增加，將細(xì)胞上清液培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，其在基質(zhì)膠上形成的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)顯著多于常氧組；Yu等[4]將低氧預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到肝切除術(shù)的動(dòng)物模型上后，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)肝再生，其機(jī)制可能是低氧預(yù)處理促進(jìn)了骨髓干細(xì)胞表達(dá)VEGF。以上結(jié)果均表明低氧預(yù)處理可通過(guò)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)VEGF來(lái)增強(qiáng)其成血管潛能。因此推測(cè)低氧預(yù)處理同樣可通過(guò)促進(jìn)hDPSCs表達(dá) VEGF增強(qiáng)其促血管生成潛能，但對(duì)這一推測(cè)的驗(yàn)證，還需要進(jìn)一步的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)等。

綜上所述，體外低氧培養(yǎng)hDPSCs可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖及VEGF的表達(dá)，雖然其機(jī)制的闡明還需進(jìn)一步的研究，但提示低氧預(yù)處理對(duì)hDPSCs的體內(nèi)移植可能是有利的。

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Effect of hypoxia preconditioning on the proliferation and angiogenic factor expression of human dental pulp stem cells

LIU Qing- na*, WU Bu- ling, CHEN Ting, CHEN Qiu- yue, LAI Ling- zhi

(*NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

AIM: To investigate the effects of hypoxia preconditioning on the proliferation and VEGF expression of human dental pulp stem cells (hDPSCs). METHODS: hDPSCs were cultured under normoxia (210 mL/L O2) and hypoxia (30 mL/L O2) respectively for 72 h. Cell surface molecules were examined by flow cytometry. MTT method was used to observe cell proliferation and Live/Dead assay was used to observe the cell viability, qRT- PCR and ELISA were performed to measure the expression of VEGF and SDF- 1. RESULTS: Strong positive expression of CD29, CD44 and CD90 was found in hDPSCs. CD34, CD45 and CD31 were negative in the cells. Dead cell was not found in both groups. hDPSCs in hypoxia group showed higher proliferation ability than that in normoxia group(P<0.05). Hypoxia significantly increased VEGF mRNA and protein expression (P<0.05), but showed no significant effect on SDF- 1 mRNA expression. CONCLUSION: Hypoxia preconditioning has no influence on hDPSCs viability, but can promote the proliferation and VEGF expression of hDPSCs.

human dental pulp stem cells(hDPSCs); hypoxia preconditioning; VEGF; SDF- 1

2014-09-22;

2015-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371137)

劉慶娜(1987-)，女，漢族，河南安陽(yáng)人。碩士生(導(dǎo)師：吳補(bǔ)領(lǐng))

吳補(bǔ)領(lǐng)，E-mail: bulingwu@smu.edu.com

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0068-05