賴玲芝, 吳補(bǔ)領(lǐng), 徐會(huì)勇, 陳秋月, 劉慶娜

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510515)

周期性張應(yīng)力對(duì)人牙周膜細(xì)胞Periostin表達(dá)的影響

賴玲芝1,2, 吳補(bǔ)領(lǐng)1,2, 徐會(huì)勇1,2, 陳秋月1,2, 劉慶娜1,2

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510515)

目的: 研究在機(jī)械力作用下人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)內(nèi)Periositn(PN)mRNA和蛋白的表達(dá)變化。方法: 采用組織塊酶消化法培養(yǎng)hPDLCs，經(jīng)鑒定后將第4代細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組(非加力組)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別采用Flexcell- 5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)hPDLCs加載6、12、24、48 h的周期性張應(yīng)力；然后采用qRT- PCR、Western blot分別檢測(cè)各組hPDLCs中PN mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果: 在正常hPDLCs中表達(dá)PN mRNA和蛋白；與對(duì)照組相比，加力6 h后，PN mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；加力12 h后，PN mRNA和蛋白的表達(dá)均逐漸升高，并持續(xù)至24 h達(dá)最高水平(P<0.05)；而在加力48 h時(shí)，PN mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，并恢復(fù)至對(duì)照組的表達(dá)水平(P>0.05)。結(jié)論: 機(jī)械力可誘導(dǎo)hPDLCs中PN的表達(dá)增強(qiáng)及活化，且具有時(shí)間依賴性；提示PN可能參與了細(xì)胞內(nèi)生物力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

周期性張應(yīng)力; 人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs); periositn; 牙周組織改建

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2):79]

通過機(jī)械力啟動(dòng)牙周膜細(xì)胞的生理反應(yīng)是正畸牙齒移動(dòng)的直接原因，而細(xì)胞外基質(zhì)的改建則是正畸牙齒移動(dòng)的基礎(chǔ) 。牙周膜細(xì)胞作為矯治力的直接效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)其受到機(jī)械應(yīng)力作用時(shí)，會(huì)發(fā)生形態(tài)和功能狀態(tài)的變化，并可通過特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)機(jī)械力做出反應(yīng),從而引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)[1-3]；在此過程中，不僅合成人牙周膜細(xì)胞外基質(zhì)中大多數(shù)的各型膠原纖維和蛋白多糖，而且還通過分泌和合成多種多樣的細(xì)胞因子與酶共同參與調(diào)節(jié)牙周組織的代謝和改建。

Periositn(PN)是新發(fā)現(xiàn)的一種多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在骨膜和牙周膜中特異性表達(dá)，屬成束蛋白( fasciclin) 家族成員，分子量為90 kD。近年來的一系列體內(nèi)和體外研究表明，PN可促進(jìn)纖維的分化和成熟，在維護(hù)牙周組織的完整性、牙齒的發(fā)育、萌出以及機(jī)械應(yīng)激導(dǎo)致的組織修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要的作用，被認(rèn)為是一種對(duì)牙周膜穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[4]；并推測(cè)其可能對(duì)正畸牙移動(dòng)中牙周組織的改建也起著關(guān)鍵的作用。目前PN僅僅限于嚙齒類動(dòng)物的牙和牙周組織的體內(nèi)外試驗(yàn)性研究，但從體外細(xì)胞基因和蛋白水平研究正畸牙齒移動(dòng)過程中人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)中PN的表達(dá)變化尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用Flexcell- 5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞加載周期性張應(yīng)力，以模擬正畸牙齒移動(dòng)過程中的施力方式，并通過qRT- PCR和Western blot測(cè)定機(jī)械張應(yīng)力對(duì)hPDLCs中PN表達(dá)的影響，為進(jìn)一步系統(tǒng)性探討機(jī)械力作用下牙周組織改建的分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原酶、2.5 g/L 胰酶(Gibco 公司，美國(guó))；胎牛血清(Corning 公司，美國(guó))；Trizol逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒(Takara公司,日本)；羊抗人、鼠多克隆PN抗體(Abcam公司，美國(guó))；PVDF膜(Millipore, 德國(guó))；Flexcell 5000XT 細(xì)胞力學(xué)裝置(Flexcell公司，美國(guó))；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；羅氏480熒光定量PCR儀(ABI公司，美國(guó))；電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀制膠器(Amersham Biosciences公司，美國(guó))。

1.2 hPDLCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 hPDLCs的分離和培養(yǎng)

取12～18歲志愿者因正畸減數(shù)而新鮮拔除的牙周組織健康的前磨牙，立即置于含雙抗(青、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液中，并用含雙抗的PBS沖洗3遍；然后在無菌濕潤(rùn)條件下刮取根中1/3的牙周膜組織，用PBS沖洗并離心后加入200μLⅠ型膠原酶，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min；終止消化并離心后，將組織塊平整置于6孔板中，上蓋無菌蓋玻片，每孔加入2 mL含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。次日首次換液，以后每3 d換液1次，并用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；待細(xì)胞從組織塊中爬出并鋪滿瓶底達(dá)80%時(shí)進(jìn)行首次傳代。

1.2.2 hPDLCs的鑒定

取第3代hPDLCs經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，采用常規(guī)ABC免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別進(jìn)行波形絲蛋白(Vmentin)、角蛋白 (Cytokeratin)染色，倒置相差顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，并判斷是否符合中胚層來源的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的特征[5-7]。鑒定正確后，取第4～6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞張應(yīng)力加載

取生長(zhǎng)狀況良好的hPDLCs，以5×105/mL 的密度接種于包被I型膠原的BioFlex 6孔板彈性基底膜內(nèi)，為使細(xì)胞同步化，在細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，更換含20 mL/L FBS為DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，將細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組采用Flexcell- 5000 Tension System應(yīng)力加載系統(tǒng)分別加載6、12、24、48 h；對(duì)照組不加力，在相同條件下靜態(tài)培養(yǎng)。力學(xué)刺激滿足形變率為10%，頻率為0.5 Hz，波形為正弦波[8]。

1.4 qRT- PCR檢測(cè)機(jī)械張應(yīng)力作用下PN mRNA的表達(dá)

應(yīng)力加載結(jié)束后，用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，并用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，用SYBR Select Master Mix試劑盒和羅氏480熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT- PCR檢測(cè)；所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，具體序列見表1；反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃延伸15 s，循環(huán)40次。利用羅氏480熒光定量PCR System聯(lián)機(jī)軟件進(jìn)行Ct值相對(duì)定量分析，分別計(jì)算各組PN mRNA相對(duì)表達(dá)量。每組3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.5 Western blot檢測(cè)周期性張應(yīng)力作用下PN蛋白的表達(dá)

取應(yīng)力加載結(jié)束后的各組細(xì)胞，分別在其BioFlex 6孔板的各孔中各加250 μL含PMSF的裂解液裂解細(xì)胞；細(xì)胞裂解后離心取上清液，加入20 μL 2×SDS 上樣緩沖液混勻，煮沸3～5 min后離心取上清進(jìn)行 SDS- PAGE蛋白電泳。電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并將其放入平皿中；加入封閉液搖動(dòng)封閉1 h后，再加入用封閉液稀釋的一抗(1 ∶500)搖動(dòng)孵育1 h，并4 ℃過夜；分別用PBS洗膜3次(每次5～10 min)、TBS洗膜1次(每次5～10 min)后，加入TBS配制的10 g/L脫脂奶粉溶液稀釋的二抗(1 ∶1000)，37 ℃搖動(dòng)反應(yīng) 1～2 h；再次用TBS洗膜3次(每次5～10 min)后用電化學(xué)發(fā)光顯色劑進(jìn)行顯色，暗室下曝光顯影，并用Quanlity one分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析對(duì)總體進(jìn)行比較，若方差齊，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)；若方差不齊，則選用Dunnett's T3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

2.1.1 hPDLCs形態(tài)學(xué)觀察

組織塊酶消化法連續(xù)培養(yǎng)5～10 d時(shí)，可見細(xì)胞從組織塊中游出，并以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長(zhǎng)，有時(shí)互相連接成網(wǎng)狀；細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形或星形，核為圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清(圖1)。 傳代擴(kuò)大培養(yǎng)后，細(xì)胞貼壁性能良好，并可穩(wěn)定傳代(圖 2)。

2.1.2 細(xì)胞來源鑒定結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示：細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)棕黃色，陽性顆粒分布均勻，胞核清晰無染色(圖3)；而抗角蛋白染色陰性(圖4)。表明所培養(yǎng)的細(xì)胞符合中胚層來源的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的特征。

圖1 hPDLCs原代培養(yǎng)第7天(×100)圖2 第3代hPDLCs(×40)圖3 抗波形蛋白陽性染色圖(×100)圖4抗角蛋白陰性染色圖(×100)

2.2 加力不同時(shí)間對(duì)hPDLCs PN mRNA表達(dá)的影響

在正常hPDLCs內(nèi)表達(dá)PN，加載張應(yīng)力6 h后，PN表達(dá)降低，而加力12 h后，PN表達(dá)開始增強(qiáng)，并持續(xù)增強(qiáng)至加力24 h達(dá)最高峰，加力48 h后開始減弱；其中加力6 h和24 h組分別與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而加力12 h和48 h組與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5)。

2.3 加力不同時(shí)間對(duì)hPDLCs PN蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組PN蛋白的表達(dá)與mRNA的表達(dá)變化一致，即在正常hPDLCs中有PN蛋白的表達(dá)，與之相比，PN蛋白的表達(dá)在細(xì)胞加載張應(yīng)力6 h時(shí)，明顯降低(P<0.05); 加力到12 h后開始升高并達(dá)到對(duì)照組水平(P<0.05)；加力24 h時(shí)，達(dá)到最高(P<0.05)；而在加力48 h時(shí)開始下降，恢復(fù)至對(duì)照組的表達(dá)水平(P>0.05)(圖6)。

圖5 加力不同時(shí)間點(diǎn)hPDLCs PN mRNA的表達(dá)變化

圖6 加力不同時(shí)間點(diǎn)hPDLCs PN蛋白的表達(dá)變化

3 討論

本結(jié)果顯示，hPDLCs中的PN基因和蛋白表達(dá)水平在應(yīng)力作用下有明顯的變化，并具有時(shí)間相關(guān)性。但是，由于hPDLCs在口腔內(nèi)處在復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境中，使得實(shí)驗(yàn)條件不易控制，無法從單一因素來研究力學(xué)刺激對(duì)hPDLCs的結(jié)構(gòu)、功能的影響。因此，應(yīng)用體外細(xì)胞加力裝置，研究細(xì)胞如何精確地控制并模擬生物牽張力對(duì)細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前廣泛應(yīng)用的力學(xué)模型有：離心力加載裝置[9]、流體剪切力加載裝置[10]、基底形變加載裝置[11]等，其中基底形變加載裝置產(chǎn)生的主要是牽張力，與牙周膜細(xì)胞在口腔內(nèi)主要受牽張力的影響基本一致[12]。所以本實(shí)驗(yàn)采用目前應(yīng)用最廣泛、最理想的Flexcell 5000XT 體外細(xì)胞拉伸加力裝置[13]，以模擬正畸牙移動(dòng)過程中的方式；并探討機(jī)械張應(yīng)力對(duì)hPDLCs 表達(dá)PN的影響。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，周期性張應(yīng)力刺激6 h組的 hPDLCs中 PN的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯減弱，但在加力12 h后，兩者的表達(dá)均出現(xiàn)回升。提示，在應(yīng)力作用的早期階段，受力細(xì)胞可能對(duì)應(yīng)力刺激做出了保護(hù)性反應(yīng)；隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸適應(yīng)了應(yīng)力的作用并隨之做出積極的反應(yīng)，同時(shí)也說明hPDLCs對(duì)張應(yīng)力的適應(yīng)較快。加力24 h后，hPDLCs 中的PN mRNA和蛋白的表達(dá)水平均達(dá)到最高峰(P<0.05)；而在加力48 h 時(shí)，兩者的表達(dá)均有所下降，并恢復(fù)至對(duì)照組的表達(dá)水平(P>0.05)，表明在周期性張應(yīng)力作用下，適宜的加力時(shí)間可促進(jìn)PN的表達(dá)，但過長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)降低PN的表達(dá)。該結(jié)果與Wilde等[14]的研究結(jié)果一致，Wilde等對(duì)7周齡雄性SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)，并在加力后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量其牙周膜中PN mRNA的表達(dá)；結(jié)果顯示，加力24 h后PN mRNA的表達(dá)最強(qiáng)，牙齒移168 h后PDL中PN mRNA的表達(dá)表現(xiàn)出與對(duì)照類似的分布。Wen等[8]在研究TGF- β1和FAK對(duì)Periostin在牙周成纖維細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單軸應(yīng)力循環(huán)加載于牙周成纖維細(xì)胞48 h后，其Periostin的mRNA表達(dá)水平高于加力24 h組，與本結(jié)果有所不同。分析原因可能與加力方式不一致有關(guān)，加之Wen等的實(shí)驗(yàn)僅設(shè)計(jì)兩個(gè)加力時(shí)間點(diǎn)和一個(gè)基因水平檢測(cè)指標(biāo)；而本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并分別從基因水平和蛋白水平同時(shí)分析hPDLCs 內(nèi)PN的表達(dá)，更具有代表性。近年來已有不少學(xué)者研究了機(jī)械力對(duì)牙周膜細(xì)胞表達(dá)PN的影響，Rios等[15]報(bào)道，人工誘導(dǎo)的大鼠咬合功能減退，可使其牙周膜細(xì)胞中的PN mRNA會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)性的表達(dá)降低。fanador等[16]發(fā)現(xiàn)，小鼠右下頜磨牙的咬合功能減退后，其牙周膜細(xì)胞中的PN表達(dá)水平明顯下降。Iekushi等[17]發(fā)現(xiàn)，機(jī)械力牽拉心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均可使骨膜蛋白的表達(dá)上調(diào)。以上研究均表明，PN是力學(xué)敏感的一種細(xì)胞因子，并高表達(dá)于牙周組織。雖然上述研究的對(duì)象、方法、結(jié)果不盡相同，但PN在hPDLCs中的表達(dá)均在應(yīng)力作用下發(fā)生了變化，提示PN可能在正畸牙移動(dòng)時(shí)的牙周組織改建過程中發(fā)揮積極的作用。

現(xiàn)在 PN與TGF- β1的關(guān)系越來越受各界的關(guān)注，多項(xiàng)研究表明PN參與多個(gè)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，且其表達(dá)與 TGF- β1密切相關(guān)。PN作為TGF- β1的下游因子，具有趨化心肌纖維細(xì)胞、促進(jìn)膠原的合成和成熟的作用；并可促進(jìn)形成穩(wěn)定的膠原網(wǎng)而參與膠原重構(gòu)[18]。PN蛋白參與反饋機(jī)制主要通過TGF- β1信號(hào)系統(tǒng)刺激，由αv-整聯(lián)蛋白陽性的成纖維細(xì)胞表達(dá)，生成的PN蛋白能夠進(jìn)一步增加纖維細(xì)胞的移動(dòng)性、收縮性及其合成基質(zhì)蛋白的能力；PN在這一反饋機(jī)制中成為板機(jī)點(diǎn)。但TGF- β1信號(hào)相關(guān)通路是否也介導(dǎo)了正畸牙移動(dòng)中PN對(duì)牙周膜改建的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Expression of Periositn mRNA and protein in cultured human periodontal ligament cells after cyclic stretch

LAI Ling- zhi*, WU Bu- ling, XU Hui- yong, CHEN Qiu- yue, LIU Qing- na

(*Dept.ofStomatology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

AIM: To observe the effects of cyclic stretch on the expression of periositn(PN) in human periodontal ligament cells(hPDLCs). METHODS: Primary hPDLCs were cultured by tissue block enzymolytic method. Cells were subjected to cyclic stretch by Flexcell FX- 5000T system at 0.5 Hz of 10% elongation for 6, 12, 24 and 48 hours respectively. The mRNA and protein expression of PN were measured by qRT- PCR and western blot respectively. RESULTS: PN mRNA and protein were positively expressed in control hPDLCs. PN mRNA and protein were decreased after 6- hour cyclic stretch, then increased after 12- hour cyclic stretch and reached to the highest level after 24- hour treatment(P<0.05). After 48 hour treatment, PN expression began to decline, consistent with the expression level of the control cells. CONCLUSION: Cyclic stretch may change the expression level of PN in hPDLCs in a time- dependent manner. PN may plays an important role in cell signal transduction of mechanical strain.

cyclic stretch; human periodontal ligament cells(hPDLCs); periositn(PN); periodontal tissue remodeling

2014-08-13

廣東省高等學(xué)校人才引進(jìn)科研資助項(xiàng)目(C1030270)

賴玲芝(1985-)，女，漢族，廣東人。碩士生(導(dǎo)師： 吳補(bǔ)領(lǐng))

吳補(bǔ)領(lǐng)，E-mail：bulingwu0605@yahoo.com

R780.2

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1005-2593(2015)02-0079-05