中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

前言

藥物體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及藥物作用靶點(diǎn)基因的遺傳變異及其表達(dá)水平的變化可影響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性個(gè)體差異。近年來(lái)，隨著人類基因組學(xué)的發(fā)展，藥物基因組學(xué)領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的藥物基因組生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法相繼涌現(xiàn)。藥物基因組學(xué)已成為指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥、評(píng)估嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評(píng)價(jià)新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應(yīng)癥患者。美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）已批準(zhǔn)在140余種藥物的藥品標(biāo)簽中增加藥物基因組信息，涉及42個(gè)藥物基因組生物標(biāo)記物。此外，部分行業(yè)指南也將部分非FDA批準(zhǔn)的生物標(biāo)記物及其特性（如MGMT基因甲基化）的檢測(cè)列入疾病的治療指南。藥物反應(yīng)相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的分子檢測(cè)是實(shí)施個(gè)體化藥物治療的前提。

藥理學(xué)與遺傳學(xué)結(jié)合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括藥物代謝動(dòng)力學(xué)（PK）和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)（PD）兩方面。藥物代謝動(dòng)力學(xué)主要是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，側(cè)重于闡明藥物的體內(nèi)過(guò)程；藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要研究藥物對(duì)機(jī)體的作用、作用規(guī)律及作用機(jī)制，其內(nèi)容包括藥物與作用靶位之間相互作用所引起的生化、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，側(cè)重于解釋藥物如何與作用靶點(diǎn)發(fā)生作用。對(duì)藥物代謝酶和藥物靶點(diǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)可指導(dǎo)臨床針對(duì)特定的患者選擇合適的藥物和給藥劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

本指南旨在為個(gè)體化用藥基因檢測(cè)提供一致性的方法，所指的藥物基因組生物標(biāo)志物不包括影響抗感染藥物反應(yīng)性的微生物基因組變異。此外，腫瘤靶向治療藥物個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)指南見《腫瘤個(gè)體化治療的檢測(cè)技術(shù)指南》。

本指南起草單位：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所、中南大學(xué)臨床藥理研究所、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，并經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)專家委員會(huì)、中國(guó)藥理學(xué)會(huì)藥物基因組學(xué)專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)藥理學(xué)會(huì)臨床藥理學(xué)專業(yè)委員會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)組織修訂。

本指南起草人：周宏灝、陳小平、張偉、劉昭前、尹繼業(yè)、李智、李曦、唐潔、俞競(jìng)、彭靜波、曹杉、成瑜。

1 本指南適用范圍

本指南由國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)專家委員會(huì)制定，旨在為臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥物代謝酶和藥物靶點(diǎn)基因的檢測(cè)提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對(duì)象為開展個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測(cè)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室。

2 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)概述

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因特性的變化可影響藥物的體內(nèi)濃度和靶組織對(duì)藥物的敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性（包括藥物的療效和不良反應(yīng)發(fā)生）個(gè)體差異。藥物基因組生物標(biāo)志物的檢測(cè)是臨床實(shí)施個(gè)體化藥物治療的前提。從藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因出發(fā)，對(duì)個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的適應(yīng)人群、標(biāo)本采集、運(yùn)輸、接收、處理、樣本檢測(cè)、結(jié)果報(bào)告與解釋、室內(nèi)室間質(zhì)控需遵循的基本原則，以及可能出現(xiàn)的問(wèn)題與應(yīng)對(duì)措施等方面的內(nèi)容進(jìn)行介紹，可為基于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)的基因檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)。

3 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析前質(zhì)量保證

根據(jù)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的條件確定合適的分子診斷項(xiàng)目和恰當(dāng)?shù)臉颖咎幚硎谴_保核酸定性定量檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。檢測(cè)前必須確保標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存符合要求。標(biāo)本處置不當(dāng)可能引起核酸降解，導(dǎo)致定量檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

3.1 采樣前準(zhǔn)備

3.1.1 分子診斷項(xiàng)目的申請(qǐng)與完善：藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)在采樣前需填寫規(guī)范的申請(qǐng)單，申請(qǐng)單應(yīng)包含足夠的信息，以識(shí)別患者和有資格開具申請(qǐng)單的臨床醫(yī)生。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)臨床需求合理選擇分子診斷項(xiàng)目。個(gè)體化用藥領(lǐng)域發(fā)展迅速，臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)與臨床醫(yī)師的溝通，及時(shí)指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇有價(jià)值的診斷項(xiàng)目，幫助醫(yī)師合理解釋檢驗(yàn)結(jié)果；不斷接受正確合理的臨床醫(yī)師的反饋意見，及時(shí)了解臨床對(duì)個(gè)體化用藥分子檢測(cè)的需求，優(yōu)化項(xiàng)目目錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)其具體的工作流程確定質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)，如患者診斷信息完整率、適當(dāng)臨床判斷率等，并定期對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，定期對(duì)檢驗(yàn)申請(qǐng)進(jìn)行評(píng)審。

3.1.2 患者的正確識(shí)別及知情同意：患者的正確識(shí)別是確保獲得正確臨床標(biāo)本的前提。收集標(biāo)本的容器上應(yīng)注明患者的信息，通常應(yīng)包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號(hào)等。醫(yī)護(hù)人員在采樣前需首先核對(duì)確定患者的身份，核實(shí)標(biāo)示患者的信息。

標(biāo)本收集前應(yīng)向患者介紹個(gè)體化用藥基因檢測(cè)的意義，以得到患者的認(rèn)同，即知情同意。采樣前需告知患者所檢測(cè)項(xiàng)目的目的、意義、基本過(guò)程、項(xiàng)目可能存在的不足（如檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)與臨床用藥實(shí)際不相符的情況）、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研項(xiàng)目）及保存時(shí)間，保護(hù)受檢者的個(gè)人隱私（包括醫(yī)療記錄和醫(yī)療數(shù)據(jù)）。對(duì)實(shí)施有創(chuàng)檢查的分子診斷項(xiàng)目如穿刺取活檢組織，應(yīng)清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的風(fēng)險(xiǎn)和緊急情況下的預(yù)案。知情同意書是醫(yī)方履行如實(shí)告知義務(wù)的證據(jù)，也是患者行使選擇權(quán)的書面依據(jù)。

3.1.3 送檢單的填寫與項(xiàng)目的復(fù)核：標(biāo)本采集前需填寫送檢申請(qǐng)單，提供受檢者必需的信息。申請(qǐng)單需填寫的信息包括：申請(qǐng)的檢測(cè)項(xiàng)目、標(biāo)本編號(hào)、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時(shí)間、標(biāo)本來(lái)源（組織類型）、相關(guān)臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫(yī)師姓名等信息。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有專業(yè)人員根據(jù)信息采集表對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目的合理性進(jìn)行審核，必要時(shí)可與送檢醫(yī)師討論。

3.2 標(biāo)本采集：臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)各種個(gè)體化用藥分子診斷臨床標(biāo)本的采集按檢測(cè)要求建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。標(biāo)本采集人員應(yīng)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的培訓(xùn)。采樣前應(yīng)對(duì)標(biāo)本采集容器進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保容器本身不會(huì)干擾測(cè)定過(guò)程，并保存評(píng)估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的標(biāo)本在采集時(shí)間上無(wú)特殊要求。靜脈血液采集之前應(yīng)按要求對(duì)預(yù)采血的部位徹底消毒。腫瘤組織中DNA的分析利用常規(guī)診斷所用的標(biāo)本即可，但用于RNA分析的標(biāo)本需專門采集，并準(zhǔn)備好液氮等速凍所需的材料及設(shè)備。標(biāo)本采集需要在密閉、一次性采樣系統(tǒng)中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應(yīng)為一次性使用，以防止污染。無(wú)論采集哪種類型的標(biāo)本，采樣時(shí)都必須戴手套，以避免標(biāo)本中病原微生物感染和皮膚脫落細(xì)胞對(duì)標(biāo)本的污染。

用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的標(biāo)本類型有多種，包括全血標(biāo)本、 組織標(biāo)本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標(biāo)本）、口腔拭子、骨髓、胸腹腔積液等。樣本采樣原則見《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》。

3.2.1 全血和骨髓標(biāo)本：全血標(biāo)本采集到含有適當(dāng)抗凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據(jù)被測(cè)量種類（細(xì)胞內(nèi)DNA、 RNA）、檢測(cè)項(xiàng)目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR反應(yīng)中酶的活性，全血或骨髓標(biāo)本一般用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標(biāo)注標(biāo)本信息。全血標(biāo)本采集外周靜脈血2～3 ml并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免溶血。如檢測(cè)目的是細(xì)胞內(nèi)RNA，建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中。采集干血斑標(biāo)本時(shí)，可向無(wú)菌濾紙上滴加約50 μl全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個(gè)印圈上滴加標(biāo)本，于室溫自然干燥至少4小時(shí)。干血斑標(biāo)本采集時(shí)不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應(yīng)放入無(wú)菌袋中，避免血斑之間的相互污染，同時(shí)加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運(yùn)送。

3.2.2 組織標(biāo)本：當(dāng)待檢測(cè)的組織與血液或口腔脫落細(xì)胞基因型不一致時(shí)，或當(dāng)組織是待測(cè)核酸必須的來(lái)源時(shí)（如檢測(cè)腫瘤組織中mRNA表達(dá)、融合基因、基因擴(kuò)增或缺失、甲基化水平、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等），需采集組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)?？捎玫慕M織標(biāo)本包括新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。

① 新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類型。一般而言，無(wú)論是哪種組織類型，在沒(méi)有大量脂肪細(xì)胞侵潤(rùn)的情況下，10 mg組織標(biāo)本可提取DNA或RNA 10 μg。無(wú)菌條件下，取米粒大小手術(shù)或活檢組織（約25 mg）；腫瘤組織要求未壞死腫瘤組織比例＞70%。穿刺取實(shí)體腫瘤組織時(shí)，取得的細(xì)胞數(shù)與穿刺針的粗細(xì)有關(guān)，21G細(xì)針每次獲得≥100個(gè)細(xì)胞，19G細(xì)針每次獲得≥150個(gè)細(xì)胞，支氣管活檢每次獲得≥300個(gè)細(xì)胞，CT介導(dǎo)的細(xì)針穿刺每次可獲得≥500個(gè)細(xì)胞。通常檢測(cè)時(shí)標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量需達(dá)到200～400個(gè)。在某些情況下，要求同時(shí)采集無(wú)病變的組織或外周血作為對(duì)照（如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)）。組織塊取樣后的處理與保存見《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》。

② 石蠟包埋組織：推薦用10%中性緩沖甲醛溶液固定組織標(biāo)本，避免使用含重金屬離子的固定液（如Bouin液）等。甲醛介導(dǎo)的DNA損傷在固定3小時(shí)后明顯發(fā)生，且時(shí)間越長(zhǎng)，DNA損傷越嚴(yán)重。因此，推薦較小的組織（如活檢組織標(biāo)本）固定6～12小時(shí)，較大的組織（如手術(shù)切除標(biāo)本）固定6～48小時(shí)。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測(cè)，但在沒(méi)有其他標(biāo)本可供選擇時(shí)，可考慮選擇沒(méi)有污染部分提取的RNA用于檢測(cè)，待測(cè)RNA序列的長(zhǎng)度最好＜130 bp。組織標(biāo)本切片時(shí)應(yīng)特別注意避免標(biāo)本間的交叉污染。

③ 組織切片：用于DNA檢測(cè)時(shí)，手術(shù)標(biāo)本需提供10 μm厚的石蠟切片4～8張，面積為成人拇指蓋大?。换顧z穿刺標(biāo)本需提供10 μm厚切片8～10張。所有切片均為白片。腫瘤組織切片應(yīng)在HE染色后，經(jīng)病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否足夠（一般要求＞50%）、壞死組織比例＜10%，并在對(duì)應(yīng)的白片上畫出癌巢，對(duì)腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注。DNA測(cè)序法要求腫瘤細(xì)胞至少占組織細(xì)胞的50%。應(yīng)采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標(biāo)本時(shí)，需更換新刀片。

3.2.3 口腔脫落細(xì)胞：口腔脫落細(xì)胞可同時(shí)用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，將消毒醫(yī)用棉簽伸進(jìn)口腔，在口腔內(nèi)側(cè)臉頰粘膜處左右反復(fù)擦拭20次左右，取出棉簽，將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑料袋內(nèi)封閉并放入紙質(zhì)信封，信封上應(yīng)做好詳細(xì)標(biāo)記。濾紙應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理，以防細(xì)菌生長(zhǎng)抑制核酸酶的活性。漱口標(biāo)本也可作為口腔脫落細(xì)胞的來(lái)源。用于RNA分析的口腔脫落細(xì)胞必須保存在RNA穩(wěn)定劑中。

4 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析中質(zhì)量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，涉及基因擴(kuò)增的檢測(cè)項(xiàng)目必須在通過(guò)技術(shù)審核的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。分析中質(zhì)量控制的內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的要求；檢測(cè)程序的選擇、驗(yàn)證及確認(rèn)；儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與校準(zhǔn)；人員培訓(xùn)；樣本的準(zhǔn)備（如核酸純化等）；執(zhí)行檢測(cè)；確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定室內(nèi)SOP和參加室間質(zhì)評(píng)或?qū)嶒?yàn)室間比對(duì)。

4.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求：原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。作為藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)核心技術(shù)之一的PCR，要保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，首要措施就是防“污染”。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》要求進(jìn)行設(shè)置，并按要求嚴(yán)格控制空氣流向，避免PCR產(chǎn)物污染。

4.2 檢測(cè)方法：藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)過(guò)程一般包括核酸提取和靶標(biāo)檢測(cè)兩個(gè)階段。

用于靶標(biāo)檢測(cè)的方法包括PCR-直接測(cè)序法、PCR-焦磷酸測(cè)序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法、原位雜交（ISH）等多種方法，每種方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)如表1。

① PCR-直接測(cè)序法：也稱PCR-Sanger測(cè)序，該方法基于雙脫氧核糖核酸（ddNTP）末端終止法，根據(jù)核苷酸在某一固定點(diǎn)開始延伸，隨機(jī)在某一特定堿基處終止，由于摻入的每個(gè)堿基都進(jìn)行了熒光標(biāo)記，因此產(chǎn)生了以A、T、C、G結(jié)束的4組相差一個(gè)堿基的不同長(zhǎng)度系列核酸片段；通過(guò)毛細(xì)管電泳分離這些片段后讀取待測(cè)核酸的堿基序列。Sanger法測(cè)序是DNA序列分析的經(jīng)典方法。由于該方法可直接讀取DNA序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。

② PCR-焦磷酸測(cè)序法：本方法是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)需設(shè)計(jì)一條生物素標(biāo)記的測(cè)序引物，當(dāng)引物與單鏈模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。所需試劑包括樣本處理試劑、核酸擴(kuò)增試劑、單鏈模板制備試劑、焦磷酸測(cè)序試劑和陽(yáng)性質(zhì)控品五大類。所需儀器為PCR儀和焦磷酸測(cè)序儀。為避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分陽(yáng)性質(zhì)控品和反應(yīng)試劑的使用，防止因試劑污染致假陽(yáng)性發(fā)生。

③ 實(shí)時(shí)熒光PCR法：根據(jù)檢測(cè)原理的不同，實(shí)時(shí)熒光PCR法可分為探針?lè)ê头翘结樂(lè)▋煞N，前者利用與靶序列特異雜交的探針（Taqman和分子信標(biāo)）來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，后者利用熒光染料或特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。Taqman探針?lè)ㄍ瑫r(shí)綜合了5’端核酸酶活性和熒光等技術(shù)，其在反應(yīng)過(guò)程中使用4條寡核苷酸鏈，其中兩條為等位基因特異性探針，兩條為PCR引物。兩條探針可分別與突變型和野生型模板互補(bǔ)，其兩端分別應(yīng)用含報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的染料進(jìn)行標(biāo)記，兩條探針的報(bào)告基團(tuán)熒光染料不一樣。在進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)時(shí)，PCR擴(kuò)增的退火過(guò)程導(dǎo)致探針與模板雜交結(jié)合，當(dāng)引物延伸至探針處時(shí)，DNA聚合酶5’端外切酶活性將探針的5’端報(bào)告基團(tuán)從探針上切除，使之與淬滅基團(tuán)分離，從而釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，而沒(méi)有配對(duì)的探針仍然保持完整而不會(huì)發(fā)出熒光。不同的等位基因探針由于標(biāo)記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號(hào)不同，可通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)判斷樣本的基因型。

表1 各種藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)及適用性比較

④ PCR-基因芯片法：該方法以特定的寡核苷酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后將樣品DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記等程序，按堿基配對(duì)原理與芯片雜交，再通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而迅速獲得個(gè)體的基因型信息?；蛐酒中头ǖ牟僮鬟^(guò)程包括PCR核酸擴(kuò)增、雜交、芯片掃描和結(jié)果分析。

⑤ PCR-電泳分析：該方法是指對(duì)待分析的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。該方法屬于定性檢測(cè)，且只能用于對(duì)已知的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，不能識(shí)別未知多態(tài)性位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳法適用于對(duì)片段較長(zhǎng)的插入缺失多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）插入缺失多態(tài)性；毛細(xì)管電泳法適于對(duì)較短的插入缺失多態(tài)性如UGT1A1*28多態(tài)性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）進(jìn)行檢測(cè)。PCR過(guò)程中需建立陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，電泳分析時(shí)需同時(shí)用分子量標(biāo)記物進(jìn)行片段大小的判斷。當(dāng)分子量標(biāo)記物反應(yīng)管無(wú)條帶或出現(xiàn)較弱的條帶時(shí)，可能的原因包括點(diǎn)樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或電壓過(guò)大。該方法的優(yōu)點(diǎn)是成本低，在普通實(shí)驗(yàn)室即可開展；缺點(diǎn)是只適合對(duì)DNA插入/缺失多態(tài)性或融合基因進(jìn)行定性測(cè)定，不能用于SNP的檢測(cè)。

⑥ PCR-高分辨率熔解曲線（HRM）法：該方法通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)的熔解曲線分析進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增的熔解曲線取決于其擴(kuò)增序列，序列中一個(gè)堿基的差異都可導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化。HRM法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)這種細(xì)微的溫度變化，確定所擴(kuò)增的目的片段中是否存在突變，從而用于基因分型。HRM法分析使用LC Green等飽和熒光染料，該類染料在飽和濃度時(shí)對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結(jié)合DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝。在雙鏈DNA的變性過(guò)程中不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提升，因此，熔解曲線細(xì)微的變化可以反映擴(kuò)增片段中堿基的差異。應(yīng)用本方法進(jìn)行基因分型屬于定性分析。

⑦ 等位基因特異性PCR（AS-PCR）：又稱為擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（ARMS-PCR）。該技術(shù)的基本原理：由于Taq DNA聚合酶缺乏3’到5’端的外切酶活性，3’端錯(cuò)配的堿基會(huì)導(dǎo)致引物延伸速度變慢，當(dāng)錯(cuò)配達(dá)到一定程度時(shí)，引物延伸將終止，得不到特異長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒(méi)有與引物3’端配對(duì)的堿基，反之則有。因此，AS-PCR反應(yīng)需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，兩條非特異性引物在3’端與模板錯(cuò)配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3’端與模板完全配對(duì)時(shí)，PCR擴(kuò)增才可以進(jìn)行。PCR產(chǎn)物可通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分析和基因型的判斷。該方法也可與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合起來(lái)進(jìn)行基因分型。該方法可以用于檢測(cè)各種類型的SNP，其優(yōu)勢(shì)是靈敏度高，特別適合于對(duì)腫瘤組織中的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測(cè)，缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率較高。

⑧ PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的經(jīng)典方法之一，現(xiàn)在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性內(nèi)切酶可以特異性識(shí)別某一特定序列和結(jié)構(gòu)DNA，并對(duì)其進(jìn)行剪切的原理。限制性內(nèi)切酶通常識(shí)別雙鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產(chǎn)生較短的DNA片段。由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的嚴(yán)格性，一個(gè)堿基的變化都可以導(dǎo)致酶切活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點(diǎn)在某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)上，將會(huì)導(dǎo)致該酶只對(duì)其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對(duì)位于限制性酶切識(shí)別位點(diǎn)的SNP進(jìn)行分型時(shí)，可以使用包含該位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行溫育。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小來(lái)進(jìn)行基因分型。該方法不需要任何探針，也不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。但缺點(diǎn)也很明顯，主要是通量太低，大量分型時(shí)工作量大，并且只適用于部分SNP分型。

⑨ 原位雜交（ISH）法：ISH法以各種人體標(biāo)本，包括相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法制備的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本（福爾馬林固定石蠟包埋）作為靶標(biāo)，采用目的DNA探針與該靶標(biāo)進(jìn)行分子雜交，從而檢測(cè)相關(guān)的靶基因異常。ISH技術(shù)按照探針標(biāo)記物的類型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜交（FISH）。ISH法檢測(cè)的靶標(biāo)具有完整的細(xì)胞核，無(wú)需進(jìn)行核酸的提取。其具體的方法學(xué)原理見《原位雜交 （ISH）指南》。在藥物代謝酶和靶點(diǎn)基因檢測(cè)中，ISH法主要用于測(cè)定基因擴(kuò)增和基因缺失異常。

4.3 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)項(xiàng)目及類型（表2）：遺傳藥理學(xué)知識(shí)庫(kù)（PharmGKB）根據(jù)項(xiàng)目成熟程度將個(gè)體化用藥基因檢測(cè)項(xiàng)目分為4級(jí)，并認(rèn)為其中1級(jí)項(xiàng)目（包括1A級(jí)和1B級(jí)）滿足臨床應(yīng)用的最高標(biāo)準(zhǔn)，而4級(jí)項(xiàng)目適于臨床應(yīng)用的證據(jù)最少。1A級(jí)項(xiàng)目為同時(shí)獲臨床遺傳藥理學(xué)實(shí)施聯(lián)盟（CPIC）、認(rèn)可CPIC藥物基因組學(xué)指南的醫(yī)學(xué)會(huì)、以及美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院藥物基因組學(xué)研究網(wǎng)絡(luò)（PGRN）認(rèn)同的項(xiàng)目，這類項(xiàng)目通常經(jīng)大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)（RCT）對(duì)項(xiàng)目的意義進(jìn)行了論證；1B級(jí)項(xiàng)目有確切的臨床證據(jù)提示相關(guān)性，且這種相關(guān)性被具有一定樣本規(guī)模的研究所證實(shí)，但還需進(jìn)一步的臨床證據(jù)。根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目所涉及的基因在影響藥物反應(yīng)中的作用機(jī)制和靶分子（DNA或RNA）的不同，個(gè)體化用藥分子檢測(cè)項(xiàng)目包括藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體基因遺傳多態(tài)性檢測(cè)、藥物作用靶點(diǎn)基因遺傳變異檢測(cè)、其他基因變異檢測(cè)和藥物作用靶點(diǎn)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)四種類型。

4.4 儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)：原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)涉及的儀器設(shè)備眾多，實(shí)驗(yàn)室可參考生產(chǎn)商提供的操作說(shuō)明書編寫書面的、有案可查的預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)計(jì)劃，確定儀器設(shè)備的維護(hù)周期，建立儀器設(shè)備日常維護(hù)的SOP。對(duì)于某些計(jì)量分析儀器，應(yīng)依照我國(guó)計(jì)量法規(guī)定，由計(jì)量檢定機(jī)構(gòu)定期進(jìn)行校驗(yàn)，并保存好校驗(yàn)證書。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護(hù)包括對(duì)溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。儀器維護(hù)過(guò)程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統(tǒng)。每臺(tái)儀器應(yīng)該配備專用的清潔工具。在例行儀器的維護(hù)和保養(yǎng)后，應(yīng)填寫儀器維護(hù)保養(yǎng)記錄表。如維護(hù)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，應(yīng)及時(shí)匯報(bào)并將出現(xiàn)的問(wèn)題詳細(xì)記錄，最后由維護(hù)操作人員簽名。

4.5 人員培訓(xùn)：原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結(jié)果分析和報(bào)告等步驟。操作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果。

加強(qiáng)人員培訓(xùn)是確保檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓(xùn)分為入職培訓(xùn)、內(nèi)部培訓(xùn)和外部培訓(xùn)。通過(guò)培訓(xùn)，讓操作人員掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨(dú)立進(jìn)行質(zhì)控活動(dòng)和儀器維護(hù)的能力、可對(duì)試劑和質(zhì)控品的出入庫(kù)及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進(jìn)行準(zhǔn)確記錄，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)室工作人員在培訓(xùn)后書面確認(rèn)其已接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，閱讀并理解了相關(guān)SOP。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)其工作人員進(jìn)行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開展內(nèi)部培訓(xùn)。外部培訓(xùn)包括國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心和國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。

4.6 檢測(cè)體系的性能驗(yàn)證：原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的體外診斷試劑包括國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的試劑盒和國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)試點(diǎn)單位通過(guò)性能評(píng)定，具有嚴(yán)格SOP的自配試劑（LDT）。所有試劑都需進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)室所購(gòu)買的商業(yè)化儀器應(yīng)根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行驗(yàn)證。在報(bào)告結(jié)果之前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該證明其性能能夠滿足廠家規(guī)定的準(zhǔn)確度、精密度、線性與可報(bào)告范圍和參考區(qū)間。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)該為每個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)建立性能規(guī)范，包括適用性、準(zhǔn)確度、精密度和分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報(bào)告范圍和其他重要特性，并根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準(zhǔn)和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準(zhǔn)和質(zhì)控程序相關(guān)活動(dòng)的記錄。同時(shí)也需對(duì)檢驗(yàn)中的耗材進(jìn)行質(zhì)檢。

表2 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)項(xiàng)目及其用藥指導(dǎo)

個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測(cè)包括定性檢測(cè)和定量檢測(cè)。定性檢測(cè)的性能驗(yàn)證指標(biāo)主要包括重復(fù)性、精密度、準(zhǔn)確度（突變型的檢測(cè)能力）、分析特異性、檢出限等，可參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）的EPl2-A2文件進(jìn)行檢測(cè)。定量檢測(cè)監(jiān)測(cè)體系性能驗(yàn)證的指標(biāo)主要包括準(zhǔn)確度、精密度、線性、可報(bào)告范圍、檢出限、參考區(qū)間、靈敏度、特異性等。

線性分析可直接分析已知濃度的樣品，也可將一定濃度的樣品進(jìn)行系列稀釋后，根據(jù)稀釋因子來(lái)研究檢測(cè)值與逐步下降的預(yù)期估計(jì)濃度之間是否存在線性關(guān)系?？蓤?bào)告范圍是能夠報(bào)告的可靠的最低和最高檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)“多點(diǎn)法”進(jìn)行簡(jiǎn)單驗(yàn)證，推薦應(yīng)用5個(gè)不同濃度水平的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

LoD是指可被檢測(cè)體系檢出的最低檢測(cè)濃度，又稱最小檢測(cè)濃度或檢測(cè)底限。建立和驗(yàn)證LoD時(shí)，需同時(shí)建立、驗(yàn)證空白檢測(cè)限。檢出限一般由廠家、方法建立者完成，實(shí)驗(yàn)室LDT試劑應(yīng)確立方法的LoD。LDT試劑的性能評(píng)估包括樣品的類型與數(shù)量、所選擇的參比方法、評(píng)價(jià)指標(biāo)、準(zhǔn)確度、重復(fù)性與精密度、線性范圍、檢測(cè)范圍、分析的靈敏度與特異性、參考區(qū)間或臨界值（cut-off）及臨床性能評(píng)估結(jié)果。具體可參考國(guó)家衛(wèi)計(jì)委《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)LDT研制技術(shù)規(guī)范》。

5 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)分析后質(zhì)量保證

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。分析后質(zhì)量保證包括檢測(cè)報(bào)告、結(jié)果解釋、報(bào)告發(fā)放與咨詢、檢測(cè)后樣本的保存和處理。

5.1 檢測(cè)報(bào)告的內(nèi)容、解釋及發(fā)放

5.1.1 檢測(cè)報(bào)告的內(nèi)容及要求：檢測(cè)報(bào)告應(yīng)通俗易懂，應(yīng)在盡可能避免歧義的情況下客觀地解釋結(jié)果，以確保臨床醫(yī)生能正確解讀。

報(bào)告單要求有統(tǒng)一的格式和書寫內(nèi)容要求，報(bào)告應(yīng)包含的內(nèi)容：醫(yī)療機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室名稱、項(xiàng)目名稱、標(biāo)本編號(hào)或條碼、送檢單位及（或）科室名稱、患者信息（姓名、性別、年齡）、標(biāo)本類型、標(biāo)本采集與接收時(shí)間、送檢醫(yī)生姓名、疾病診斷、報(bào)告單出具的時(shí)間、標(biāo)本處理過(guò)程、檢測(cè)方法和主要設(shè)備、檢測(cè)過(guò)程、檢測(cè)結(jié)果并附相關(guān)圖表、結(jié)果解釋、用藥方案建議、檢測(cè)的局限、必要的參考文獻(xiàn)、檢測(cè)人員、審核人員和復(fù)核人員簽字、結(jié)果報(bào)告日期和備注、檢測(cè)單位聯(lián)系信息。

檢測(cè)結(jié)果應(yīng)以清晰易讀且易被醫(yī)師和患者理解的形式進(jìn)行報(bào)告，報(bào)告單上應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)化的基因命名和計(jì)量單位。定量檢測(cè)應(yīng)注明參考區(qū)間、檢測(cè)方法的線性或測(cè)定范圍；定性檢測(cè)可直接寫基因型、基因擴(kuò)增有無(wú)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定的程度（低、中、高）、甲基化有無(wú)等。

5.1.2 檢測(cè)結(jié)果的解釋：根據(jù)藥物基因組生物標(biāo)志物檢測(cè)指導(dǎo)個(gè)體化用藥主要包括兩種類型：一是根據(jù)個(gè)體的遺傳信息調(diào)整用藥劑量，以增加藥物療效，減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生；二是根據(jù)個(gè)體的遺傳信息確定用藥的種類，避免應(yīng)用針對(duì)特定基因型個(gè)體無(wú)效或可能產(chǎn)生嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的藥物。

藥物劑量的調(diào)整往往需根據(jù)RCT的結(jié)果；對(duì)目前缺乏RCT的遺傳變異，可依據(jù)基因型對(duì)影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)曲線下面積大小估算用藥劑量；當(dāng)一個(gè)藥物的反應(yīng)性受多個(gè)基因或基因與環(huán)境因素間相互作用影響時(shí)，可根據(jù)國(guó)內(nèi)國(guó)際大規(guī)模臨床試驗(yàn)推導(dǎo)出的納入了個(gè)體基因型及其他因素的用藥劑量計(jì)算公式確定用藥劑量。

常見藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因遺傳變異檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)建議見表2。

5.1.3 檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告流程與發(fā)放：檢測(cè)報(bào)告通常以紙質(zhì)報(bào)告單形式或以電子版通過(guò)網(wǎng)絡(luò)形式發(fā)放。藥物代謝酶和靶點(diǎn)基因檢測(cè)結(jié)果報(bào)告需要有嚴(yán)謹(jǐn)有效的流程，以確保檢驗(yàn)信息的完整、有效、及時(shí)、正確、隱私。首先要對(duì)檢測(cè)結(jié)果報(bào)告進(jìn)行審核分析，包括審核檢測(cè)過(guò)程的有效性、受檢者的基本信息、結(jié)果數(shù)據(jù)分析。審核者應(yīng)當(dāng)是主管技師以上的工作人員、本專業(yè)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人、高年資檢驗(yàn)人員和臨床實(shí)驗(yàn)室主任授權(quán)人，審核者對(duì)檢驗(yàn)報(bào)告的質(zhì)量負(fù)責(zé)。

通過(guò)審核的檢測(cè)報(bào)告可以報(bào)告單形式或通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的信息管理系統(tǒng)發(fā)放。應(yīng)建立檢測(cè)報(bào)告單發(fā)出和管理制度。明確檢測(cè)結(jié)果報(bào)告發(fā)放的程序和責(zé)任，設(shè)定并公示檢測(cè)結(jié)果報(bào)告時(shí)間，報(bào)告時(shí)間是指從接受送檢標(biāo)本起，到檢測(cè)結(jié)果發(fā)放的時(shí)間。應(yīng)制定個(gè)體化用藥基因檢測(cè)數(shù)據(jù)管理制度，數(shù)據(jù)中應(yīng)錄入患者信息和檢驗(yàn)數(shù)據(jù)；檢測(cè)數(shù)據(jù)的修改必須征得報(bào)告結(jié)果簽發(fā)人員同意后，由操作人員進(jìn)行修改；所有檢測(cè)報(bào)告和原始記錄應(yīng)當(dāng)歸檔保存，實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)至少要拷貝3份并保存在不同的地方，以便日后核對(duì)。一般檢驗(yàn)報(bào)告單和檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)至少保存兩年；室內(nèi)質(zhì)控和參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的記錄和質(zhì)控信息至少保存兩年；儀器狀態(tài)和維修記錄要保留到儀器使用終身。檢測(cè)結(jié)果的查詢通?？筛鶕?jù)患者姓名、標(biāo)本編號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目和送檢日期進(jìn)行查詢。

檢測(cè)報(bào)告發(fā)放后收到檢測(cè)報(bào)告投訴需記錄并統(tǒng)計(jì)，分析原因，避免二次錯(cuò)誤。

5.1.4 檢測(cè)后咨詢服務(wù)：個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備相關(guān)資質(zhì)、取得國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)培訓(xùn)基地培訓(xùn)合格證的個(gè)體化用藥咨詢?nèi)藛T，對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目提供咨詢服務(wù)，負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)報(bào)告在臨床上出現(xiàn)的各種情況進(jìn)行解釋和檢后服務(wù)。

5.2 檢測(cè)后樣本的保存和處理：樣本完成檢測(cè)后要進(jìn)行一定時(shí)間（盡可能長(zhǎng)期）的保留，以備必要時(shí)復(fù)查。標(biāo)本的保存也可為科研工作的開展和回顧性調(diào)查提供條件。完成檢測(cè)后剩余的DNA樣本至少在-80℃保存2年。DNA在-70℃的環(huán)境下可保存至少7年。純度不高的DNA樣品建議保存在-20℃或更低的溫度中，以確保DNA的完整性。在不影響受檢者個(gè)人隱私及利益的前提條件下，DNA及臨床資料也可匿名用于科學(xué)研究，但需在知情同意書中明確。廢棄的樣本應(yīng)作為生物危險(xiǎn)品處置。

6 藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的質(zhì)量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的質(zhì)量控制與保證是個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證的核心內(nèi)容，是個(gè)體化用藥基因診斷規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的首要前提。因此，臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目的計(jì)劃和準(zhǔn)備，試驗(yàn)性能確認(rèn)/驗(yàn)證以及檢驗(yàn)全過(guò)程都需要建立有效的質(zhì)量控制體系。

6.1 檢測(cè)確認(rèn)和特征描述：在將檢測(cè)用于臨床工作之前應(yīng)該對(duì)方法進(jìn)行分析確認(rèn)和臨床確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定待檢測(cè)的靶核酸、確定要使用的試驗(yàn)方法和建立試驗(yàn)性能確認(rèn)/驗(yàn)證的計(jì)劃和程序。確認(rèn)/驗(yàn)明程序應(yīng)該包括：檢驗(yàn)?zāi)康?；靶基因，基因序列和突變；預(yù)期患者人群；被比較的試驗(yàn)方法，或要使用的方法；使用的樣本類型；要確定的分析性能特征；參考材料的來(lái)源；如何分析性能規(guī)范；如何規(guī)定試驗(yàn)的局限性；出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)的糾正措施。

6.2 可操作性的SOP編寫：有可操作性的SOP是個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的靈魂。SOP源于儀器和試劑說(shuō)明書、一些標(biāo)準(zhǔn)文件和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)的積累，應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、標(biāo)本接收與預(yù)處理、核酸提取、測(cè)定方法、結(jié)果分析和報(bào)告、儀器操作、實(shí)驗(yàn)室安全措施等臨床檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。SOP的編寫應(yīng)注意通俗易懂、注重細(xì)節(jié)、清晰明了、圖文并茂。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)嚴(yán)格遵循SOP中的步驟要求進(jìn)行操作，當(dāng)發(fā)現(xiàn)SOP有“故障”時(shí)，經(jīng)過(guò)技術(shù)研發(fā)小組的工作人員討論、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后及時(shí)修改。

6.3 質(zhì)控品與室內(nèi)質(zhì)控

6.3.1 質(zhì)控品：所有藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)都需要選擇一定的質(zhì)控樣本進(jìn)行質(zhì)控分析。質(zhì)控樣本的選擇視檢測(cè)項(xiàng)目而定，如藥物代謝酶的SNP檢測(cè)的陰性質(zhì)控樣本可以是無(wú)相關(guān)突變的同類樣本和不含任何核酸的水樣本，陽(yáng)性質(zhì)控樣本可以為以前檢測(cè)過(guò)的特定基因突變已知的樣本或體外構(gòu)建的已含特定突變質(zhì)粒的細(xì)胞株。常用的做法為：在每次檢測(cè)時(shí)同時(shí)設(shè)立試劑對(duì)照、陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控、弱陽(yáng)性質(zhì)控，且這些質(zhì)控樣本與待檢樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，每隔一定數(shù)量的臨床標(biāo)本插入一份質(zhì)控樣本。當(dāng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)變異位點(diǎn)時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件設(shè)立針對(duì)2～3個(gè)位點(diǎn)的陰性或陽(yáng)性對(duì)照，但不同批次間要注意更換陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣品。

質(zhì)控樣本的質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度密切相關(guān)。理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：基質(zhì)一致，即與待測(cè)樣本具有相同的基質(zhì)；穩(wěn)定性好，在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件下能保持較好的穩(wěn)定性；檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該是確定的，且越接近試驗(yàn)的決定性水平越好；具有安全性，不得有生物傳染危險(xiǎn)性；單批可大量獲得，以便于長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)。

6.3.2 室內(nèi)質(zhì)量控制的方法：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理或非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷測(cè)定批次的結(jié)果是失控還是在控，是室內(nèi)質(zhì)控的核心。室內(nèi)質(zhì)量控制的方法包括統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制和非統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制兩大類。一般而言，定性檢測(cè)（如基因分型）采用非統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制，而定量檢測(cè)如基因表達(dá)水平檢測(cè)、基因甲基化水平測(cè)定、以及實(shí)驗(yàn)室“污染”所致的假陽(yáng)性定量檢測(cè)一般采用統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控。統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控主要從不精密度和偏離度兩個(gè)方面確定檢測(cè)程序或分析方法穩(wěn)定性的性能特點(diǎn)，其具體做法是在常規(guī)檢測(cè)臨床標(biāo)本時(shí)，除陰性質(zhì)控外，還要對(duì)連續(xù)的一個(gè)濃度梯度的陽(yáng)性質(zhì)控樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析判斷質(zhì)控樣本的測(cè)定結(jié)果是否偏出所用方法的測(cè)定范圍，進(jìn)而決定常規(guī)臨床測(cè)定標(biāo)本結(jié)果的有效性。統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制的前提是制定在最佳條件和常規(guī)條件下實(shí)驗(yàn)室變異的基線。在進(jìn)行不精密度測(cè)定時(shí)，一般至少對(duì)20個(gè)不同的樣本連續(xù)檢測(cè)不少于20天，每天2次。偏離度的測(cè)定可采用基準(zhǔn)線法、與參考物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果比較、與其他平行單位的檢測(cè)結(jié)果比較、與其他方法的檢測(cè)結(jié)果比較等多種方法。部分定性檢測(cè)方法因可計(jì)算出樣本中突變等位基因的比例，也可應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控方法進(jìn)行質(zhì)控分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制方法主要包括兩大類：陽(yáng)性樣本測(cè)定重復(fù)性統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法和假陽(yáng)性的統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法。陽(yáng)性質(zhì)控品測(cè)定重復(fù)性統(tǒng)計(jì)能較準(zhǔn)確地反映實(shí)驗(yàn)室儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)員操作的穩(wěn)定性，也是實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)監(jiān)控檢測(cè)結(jié)果是否可信的重要手段，其主要統(tǒng)計(jì)控制方法包括基線測(cè)定、Levey-Jennings質(zhì)控圖方法、Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法、累積和（CUSUM）質(zhì)控方法及“即刻法”質(zhì)控方法。假陽(yáng)性的統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法包括根據(jù)日?；颊邫z測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率的Levey-Jennings質(zhì)控圖和直接概率計(jì)算法兩種，其中Levey-Jennings質(zhì)控圖法是目前臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛的一種方法，適合于質(zhì)控樣本多次重復(fù)、檢測(cè)結(jié)果可用數(shù)值表示且呈正態(tài)分布的情況。

Levey-Jennings質(zhì)控圖法的具體做法是：樣本處理（核酸提?。r(shí)加入流程陰參，所有步驟與待測(cè)樣本一致；加模板時(shí)，各檢測(cè)位點(diǎn)均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照（即以流程陰參為模板，用于檢測(cè)是否發(fā)生“污染”）與一定比例的突變型/野生型陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。PCR擴(kuò)增時(shí)注意前后批次陰參和陽(yáng)參的孔槽擺放位置的隨機(jī)性。所有陰參、陽(yáng)參的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合預(yù)期值，記錄各個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。用Levey-Jennings質(zhì)控圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)質(zhì)控規(guī)則判斷檢測(cè)結(jié)果是否在控。質(zhì)控規(guī)則如下：

12S：1個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出X±2S控制線，預(yù)警；13S：1個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出X±3S控制線，失控；22S：同一批次2個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值或不同批次的2個(gè)質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出X+2S或X-2S控制線，失控；R4S：同一批測(cè)定中，2個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的差值超出4S控制線，失控；41S:4個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出X+1S或X-1S控制線，失控；7T：7個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)出向上或向下的趨勢(shì)，失控；10X：10個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（X）的同一側(cè)，失控。

只有當(dāng)使用所有質(zhì)控規(guī)則判斷確定測(cè)定值在控時(shí)的檢測(cè)結(jié)果方為可信結(jié)果，而只要上述質(zhì)控規(guī)則之一判斷測(cè)定值失控即認(rèn)為該測(cè)定值失控。陰參檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，也判定為失控。一旦失控出現(xiàn)，當(dāng)日所有檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，必須暫停實(shí)驗(yàn)并及時(shí)查明原因，采取改進(jìn)措施，直至測(cè)定結(jié)果在控后方可重新開始臨床檢測(cè)。每次出現(xiàn)失控情況需填寫失控記錄，詳細(xì)記錄失控原因、采取措施及其效果，失控報(bào)告應(yīng)及時(shí)通報(bào)公布，以免反復(fù)出現(xiàn)同一原因?qū)е碌氖Э亍?/p>

6.4 室內(nèi)質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有專人對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程各個(gè)階段及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。在日常臨床診斷服務(wù)過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)本結(jié)果偏高、偏低或檢測(cè)為陰性，或陰性質(zhì)控品檢測(cè)為陽(yáng)性，則應(yīng)立刻查找失控原因，并采取預(yù)防措施。

陽(yáng)性質(zhì)控品失控常見的原因包括：模板問(wèn)題、引物或探針問(wèn)題、儀器問(wèn)題或試劑問(wèn)題。應(yīng)對(duì)策略包括：純化核酸、高濃度小量分裝、避免核酸反復(fù)凍融、換用新的檢測(cè)試劑、標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定、對(duì)可能含PCR擴(kuò)增抑制物的標(biāo)本進(jìn)行稀釋等。

陰性質(zhì)控品呈陽(yáng)性提示核酸“污染”，污染來(lái)源可能是擴(kuò)增產(chǎn)物和（或）核酸提取過(guò)程中的交叉污染。如果臨檢標(biāo)本全為陽(yáng)性，提示擴(kuò)增產(chǎn)物或試劑污染，應(yīng)更換試劑或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室清潔、通風(fēng)；如果臨檢標(biāo)本部分陽(yáng)性、部分陰性，考慮為擴(kuò)增產(chǎn)物輕度污染或標(biāo)本間交叉污染，可通過(guò)對(duì)5～8份水樣品進(jìn)行檢測(cè)，查明污染來(lái)源，陽(yáng)性提示實(shí)驗(yàn)室污染，則應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室清潔、通風(fēng)，陰性要提醒臨檢人員注意操作過(guò)程。

6.5 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)：臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（EQA），對(duì)待EQA樣本不能特殊化，詳細(xì)、如實(shí)地記錄參與EQA的全過(guò)程，根據(jù)反饋結(jié)果了解本實(shí)驗(yàn)室的能力，自查存在的問(wèn)題，及時(shí)尋求改進(jìn)方法，解決問(wèn)題，完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系，以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室更好的發(fā)展。EQA評(píng)分包括絕對(duì)評(píng)分和相對(duì)評(píng)分。絕對(duì)評(píng)分就是看實(shí)驗(yàn)室對(duì)該次所有質(zhì)評(píng)樣本檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符的標(biāo)本總數(shù)占該次全部樣本的百分比，大部分項(xiàng)目絕對(duì)評(píng)分大于80%即可視為檢測(cè)結(jié)果滿意或合格。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)的EQA還需對(duì)檢測(cè)報(bào)告的填寫規(guī)范程度、文字錯(cuò)誤、報(bào)告清晰度、結(jié)果報(bào)告揭示的充分性等進(jìn)行評(píng)價(jià)。

為保證室間質(zhì)評(píng)的質(zhì)量，需要注意以下幾點(diǎn)：① 參加質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告結(jié)果要清楚、簡(jiǎn)潔；② 參加質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)室使用與常規(guī)樣本完全相同的方法來(lái)測(cè)定室間質(zhì)控樣本；③ 室間質(zhì)評(píng)報(bào)告要迅速及時(shí)；④ 室間質(zhì)評(píng)樣本的來(lái)源和濃度與臨床患者標(biāo)本要盡量一致；⑤ 室間質(zhì)評(píng)樣本必須在發(fā)放條件下穩(wěn)定；⑥ 不存在不可避免的傳染危險(xiǎn)。

7 制 度

臨床檢驗(yàn)過(guò)程中需遵守國(guó)家對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)和臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的其他相關(guān)規(guī)定。

① 醫(yī)療機(jī)構(gòu)及臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)管理?xiàng)l例：《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄》《醫(yī)療質(zhì)量控制中心管理辦法（試行）》《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量手冊(cè)》《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所基本標(biāo)準(zhǔn)（試行）》。

② 標(biāo)本處理的相關(guān)條例：《血站質(zhì)量管理規(guī)范》《血站實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理規(guī)范》《血液標(biāo)本留取程序》《血液檢驗(yàn)樣本目測(cè)檢查標(biāo)準(zhǔn)》《血液的貯存發(fā)放與運(yùn)輸管理程序》和《血液樣本接收處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》。

③ 醫(yī)療廢物處理的相關(guān)條例：《醫(yī)療廢物管理制度》。