Espin為Usher綜合征II型候選致病基因

韋 博，郝繼龍，吳新民，王 樂＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼科，吉林 長(zhǎng)春130021）

Usher綜合征是一種以漸進(jìn)性的視力下降和聽力損失或耳聾為主的一種綜合征[1－3]。視力喪失表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞受損后視力下降，聽力主要表現(xiàn)先天性不同程度的聽力喪失。眾所周知，whirlin，espin，vlgr－1這3個(gè)蛋白在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的連接纖毛和內(nèi)耳耳蝸毛細(xì)胞里組成USH2蛋白復(fù)合體，其中任何一個(gè)蛋白的缺失都會(huì)導(dǎo)致USH2疾病的發(fā)生，但這3個(gè)蛋白并不能完全解釋該疾病的發(fā)生，所以我們相信還有更多未知的蛋白參與USH2蛋白復(fù)合體的組成，這些蛋白極有可能是組成USH2蛋白復(fù)合體的重要蛋白，而編碼這些蛋白的基因也是USH2候選基因之一[4－6]。我們用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)espin是USH2蛋白復(fù)合體的一個(gè)新成員，為研究USH2復(fù)合體的生物功能及由于這個(gè)復(fù)合體的缺陷導(dǎo)致Usher綜合征II型的機(jī)制提供了嶄新的研究途徑。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑

共聚焦顯微鏡（model FV1000，Olympus，Tokyo，Japan）。源于兔的多克隆espin抗體（K－14）購(gòu)于Santa Cruz生物技術(shù)公司。源于兔的多克隆GFP抗體購(gòu)買于Abcam。鏈霉素和所有二抗都購(gòu)買于Invitrogen公司（Carlsbad，CA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 從小鼠視網(wǎng)膜克隆出來(lái)的whirlin全長(zhǎng)cDNA（NP＿082916）。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物（Invitrogen公司合成），以鼠來(lái)源的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s，循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.2.2 熒光素酶載體的構(gòu)建 擴(kuò)建得到的998bp產(chǎn)物凝膠電泳純化回收后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。分別酶切純化的擴(kuò)增片段和質(zhì)粒片段用T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)胞，先菌液PCR初步篩選陽(yáng)性克隆，再通過(guò)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證，即得到含有whirlin的cherry的重組質(zhì)粒。同理操作含有 whirlin的pEGFP－C2，pDsRed2－C1質(zhì)粒；pcDNA3.1（－）質(zhì)粒。上述DNA重組質(zhì)粒均已經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)正確。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) COS－7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞都用含有5%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到60%左右，參照TurboFectTM體外轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞實(shí)行瞬間轉(zhuǎn)染，12h后觀察其熒光蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行一次更換細(xì)胞培養(yǎng)液。再孵育6h。待熒光表達(dá)充分后置于共聚焦顯微鏡下觀察并照像。

1.2.4 免疫共沉淀 將轉(zhuǎn)染成功的HEK293細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后并用超聲波間斷超聲裂解，離心轉(zhuǎn)數(shù)18 000g，10mim，將上清液中加入蛋白G，充分搖勻1h，離心后向上清液中加入一抗搖勻3h，離心轉(zhuǎn)數(shù)18 000g 8min。于上清液中加入蛋白G，搖勻1h。，用裂解液洗沉淀物3次，再煮沸10min。所有實(shí)驗(yàn)步驟均在4。C條件下進(jìn)行操作。最后將實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行western－blot。PVDF膜用含有8%脫脂牛奶孵育1.5h，加入相應(yīng)的一抗抗體于4℃過(guò)夜孵育，洗滌5min，共3次，再加入相應(yīng)的二抗孵育1h，最后進(jìn)行顯色，觀察所需的蛋白條帶。

1.2.5 共定位分析 于倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功并可見熒光蛋白表達(dá)的COS－7細(xì)胞，用4%福爾馬林在－20℃條件下固定細(xì)胞5min，洗滌后用5%山羊血清（Goat Serum，GS）／PBS孵育2h，一抗4℃孵育24h，洗滌后用相應(yīng)的二抗孵育1h，Hoechst dye 33342／5%GS／PBS孵育3min，覆蓋蓋玻片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察、照像保存染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫共沉淀證明 Whirlin與Espin相互作用

證實(shí)whirlin與espin相互作用，我們用whirlin質(zhì)粒和用帶GFP熒光的espin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) （圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于兔的whirlin抗體能夠沉淀下用GFP標(biāo)記的espin蛋白，說(shuō)明這兩個(gè)蛋白存在相互作用 （圖1）。

圖1 Whirlin與espin相互作用

2.2 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染證明whirlin與espin在細(xì)胞質(zhì)中共定位

在whirlin單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，沒有標(biāo)記的whirlin表現(xiàn)出彌漫的信號(hào)模式。在whirlin和espin雙轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，我們進(jìn)行染色并仔細(xì)觀察，我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中部分共定位。whirlin和espin的部分共定位同樣表明whirlin和espin很有可能存在相互作用（圖2）。

3 討論

最新研究發(fā)現(xiàn)，在野生鼠中，肌動(dòng)蛋白和靜纖毛偶聯(lián)蛋白對(duì)靜纖毛發(fā)育都尤為重要。Espin是一種偶聯(lián)肌動(dòng)蛋白（actin）微絲，并促進(jìn)肌動(dòng)蛋白肌束的形成，主要通過(guò)阻止一端肌動(dòng)蛋白肌束拆卸的同時(shí)，在另一端和促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲聚合，從而使肌動(dòng)蛋白束不斷延長(zhǎng)或者穩(wěn)定。Espin蛋白主要在內(nèi)耳和睪丸中表達(dá)，內(nèi)耳的靜纖毛主要負(fù)責(zé)將聲波轉(zhuǎn)化為肌電反應(yīng)，是由許多緊密連接、排列均勻一致的極性肌動(dòng)蛋白微絲構(gòu)成[7－9]。通過(guò)對(duì)whirlin與espin的相互作用研究，我們發(fā)現(xiàn)在體外whirlin與espin部分共定位，兩蛋白之間存在直接的相互作用。這對(duì)于研究USH綜合征II型的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索和方向。但至于這兩個(gè)蛋白在什么情況下結(jié)合，在怎樣的條件下還有待于我們進(jìn)一步研究和探討。

[1]Boughman JA，Vernon M，Shaver KA.Usher syndrome：definition and estimate of prevalence from two high－risk populations[J].J Chronic Dis，1983，36（8）：595.

[2]Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa[J].Lan cet，2006，368（9549）：1795.

[3]Keats BJ，Corey DP.The usher syndromes[J].Am J Med Genet，1999，89（3）：158.

[4]Reiners J，Nagel－Wolfrum K，Jurgens K，et al.Molecular basis of human Usher syndrome：deciphering the meshes of the Usher protein network provides insights into the pathomechanisms of the Usher disease[J].Exp Eye Res，2006，83（1）：97.

[5]Williams DS.Usher syndrome：animal models，retinal function of Usher proteins，and prospects for gene therapy[J].Vision Res，2008，48（3）：433.

[6]Yang J，Wang L，Song H，et al.Current understanding of usher syndrome type II[J].Frontiers in Bioscience in press，2012，17（1）：1165.

[7]Lin HW，Schneider ME，Kachar B.When size matters：the dynamic regulation of stereocilia lengths[J].Curr Opin Cell Bio，2005，2，17（1）：55.

[8]Manor U，Kachar B.Dynamic length regulation of sensory stereocilia[J].Semin Cell Dev Biol，2008，19（6）：502.

[9]Frolenkov GI，Belyantseva IA，F(xiàn)riedman TB，et al.Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells[J].Nat Rev Genet，2004，5（7）：489.