俞建良，張俊奇，蔡金亮，王學(xué)領(lǐng)，羅 菊，趙 丹，安麗娜，李春燕

(梅河口市阜康酒精有限責(zé)任公司，吉林梅河口 135000)

傳統(tǒng)乙醇工藝采用谷物進(jìn)行發(fā)酵并通過蒸餾的方式提取乙醇，此種方法會產(chǎn)生高濃度BOD 和COD 清液[1]。酒精企業(yè)通常采用生產(chǎn)高蛋白飼料原料（DDGS）、厭氧-好氧處理、回用拌料等方式對清液進(jìn)行處理[2-4]，近年來，也有部分企業(yè)嘗試?yán)镁凭l(fā)酵副產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)合肥、生物發(fā)酵飼料、益生菌的生產(chǎn)及色素、活性成分醇溶解蛋白的提取等[5-8]。目前，大多數(shù)酒精生產(chǎn)企業(yè)采用生產(chǎn)高蛋白飼料原料和回用拌料聯(lián)合應(yīng)用的方式進(jìn)行清液處理。

清液作為酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，內(nèi)部含有大量的氨基酸、可溶性糖、維生素等物質(zhì)[9]，用于酒精發(fā)酵用配料水，一方面可以為酵母生長提供營養(yǎng)，另一方面可降低一次水等生產(chǎn)用水成本[10]。清液內(nèi)也存在乳酸、琥珀酸、乙酸、蘋果酸等微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸和K+、Ca2+等金屬離子，這些物質(zhì)會對酵母發(fā)酵產(chǎn)生不同程度的抑制作用[11-14]。分析清液對酒精發(fā)酵的影響，探索適宜酒精生產(chǎn)的清液回配比例，有利于在保證酒精生產(chǎn)企業(yè)穩(wěn)定運行的同時，降低生產(chǎn)能耗，提升企業(yè)效益。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料和菌種：脫胚玉米粉，取自梅河口市阜康酒精有限責(zé)任公司；安琪濃醪釀酒高活性干酵母。

試劑及耗材：氨水（AR）、硫酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、葡萄糖（AR）、硫酸銅（AR）、酒石酸鉀鈉（AR）；淀粉酶（260000 U/g），濟(jì)南百斯杰生物工程有限公司；糖化酶（360000 U/g），蘇州宏達(dá)制酶有限公司；蛋白酶（100000 U/g），山東隆科特酶制劑有限公司。

儀器設(shè)備：ZXFD-B56000 型烘箱，上海智城分析儀器制造有限公司；ML204T 型電子天平，梅特勒-托利多公司；JA5002 型電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；SUB Aqua Pro 型電熱恒溫水浴鍋，Grant；IKA RW20 型攪拌器，IKA；ZWY-2012C0型恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司；FE20 型pH 計，梅特勒-托利多公司；1260 IntinityⅡ型高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；X-15R 型高速離心機(jī)，貝克曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液化試驗

稱取相應(yīng)物料克數(shù)至恒重的反應(yīng)器中，加入70 ℃的左右自來水，與物料混合均勻，總體系為1000 g。用pH 計調(diào)節(jié)至6.0（加入1 mL 的氨水，剩余部分通過20 %氫氧化鈉和65 %硫酸進(jìn)行調(diào)整），分別加入稀釋后的液化酶1 mL（0.3 kg/t 酒），將燒杯放入溫度維持在90 ℃的水浴鍋內(nèi)，調(diào)整攪拌速度為160 r/min，水浴10 min，調(diào)整攪拌速度為60 r/min，水浴170 min完成液化試驗。

表1 不同清液回配比例實驗配料方案

表2 不同濃度清液連續(xù)回配實驗配料方案

1.2.2 發(fā)酵試驗

將1.2.1 中液化醪降溫至32 ℃，pH 調(diào)至4.0～4.2，取350 g液化醪加入1000 mL三角瓶中，稱取兩種酵母各2.5 g 加入100 mL 滅菌水中，35 ℃條件下活化20 min，取2.5 mL 活化液加入三角瓶中，再分別加入稀釋后的糖化酶1 mL（1.0 kg/t 酒）及蛋白酶1 mL（0.2 kg/t 酒）于三角瓶中混合均勻，將三角瓶口用棉塞封堵，置于恒溫?fù)u床內(nèi)，轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵溫度控制為32 ℃，發(fā)酵時間為70 h，取樣滴定全分析及HPLC乙醇分析檢測。

1.2.3 清液制備

發(fā)酵完成后，取成熟醪液裝入離心管內(nèi)，放置于離心機(jī)中，在3000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心3 min，收集離心上清液，將收集好的離心上清液放入燒杯中，隔水（80 ℃）加熱直至體積蒸發(fā)掉50 %，向蒸發(fā)后的清液中補充已蒸發(fā)體積的蒸餾水，制得清液。

1.2.4 分析檢測

液化醪粘度測定：旋轉(zhuǎn)粘度計法。

液化醪干物測定：烘箱法。

殘?zhí)菧y定：斐林試劑法[15]。

成熟醪的分析：采用1260 IntinityⅡ型安捷倫色譜進(jìn)行測定，色譜柱：HPX-87H，300×7.8 mm；流動相：0.005 mol/L H2SO4；泵流：0.6 mL/min；柱溫：65 ℃；RID 設(shè)置溫度：50 ℃；進(jìn)樣量：15 μL；運行時間：50 min[16]。

1.2.5 計算公式

殘淀粉、殘糊精的計算方法[17]：

殘淀粉=（殘總糖-過濾總糖）×0.9；

殘糊精=（過濾總糖-還原糖）×0.9。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同清液回配比例影響分析

2.1.1 不同清液回配比例對液化的影響分析

通過對不同清液回配比例液化醪對比分析（見圖1）可知，隨著清液回配比例的增加，液化醪干物和粘度均明顯增長，主要原因是清液內(nèi)含有糖類、糊精、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，隨著回配比例的增加，固形物含量隨之增高。清液回配增大了醪液的粘度，對醪液流動、換熱，酵母擴(kuò)散均存影響，會增大生產(chǎn)負(fù)荷。

圖1 不同清液回配比例實驗液化醪干物及粘度對比

2.1.2 不同清液回配比例對發(fā)酵的影響分析

含氮化合物有3 種代謝途徑：（1）直接用于生物合成；（2）間接用于生物合成；（3）通過轉(zhuǎn)氨基作用降解，釋放出游離態(tài)NH4+或結(jié)合氮，滿足細(xì)胞代謝需求[18]。通過對不同清液回配比例發(fā)酵失重對比分析（見表3）可知，隨著清液回配比例的增加，發(fā)酵醪失重量、失重速率均明顯增加。其主要原因是在相同氮源條件下，清液內(nèi)含有的酵母溶解物為酒精發(fā)酵提供了可直接利用的額外的氮源，提升了酵母的生長及反應(yīng)速率，進(jìn)一步促進(jìn)了酒精發(fā)酵。

表3 不同清液回配比例實驗發(fā)酵失重表

酵母溶解物中富含低分子肽以及氮、磷、鉀等礦物質(zhì)和生長因子，能夠在補充酒精發(fā)酵中酵母所需的酶激活因子的同時，改善酒母繁殖、發(fā)酵能力，提高酒母出芽率，提高原料的利用率[19]。通過對不同清液回配比例發(fā)酵成熟醪酒精度及酵母死亡率對比（見圖2）可知，隨著清液回配比例的增加，成熟醪酒精度及酵母死亡率均隨之增長，清液60 %回配實驗組較清液0 %回配實驗組成熟醪酒精度提高0.43 %vol，酵母死亡率增長26 %。主要原因是清液內(nèi)含有的酵母溶解物促進(jìn)了酵母生長，加快了發(fā)酵速率。

圖2 成熟醪酒精度及酵母死亡率對比

無機(jī)離子對淀粉酶活性的影響機(jī)理很復(fù)雜,一般認(rèn)為,無機(jī)離子是通過改變酶蛋白的構(gòu)象影響酶活性的，其中Na+、K+、Mg2+在一定濃度范圍內(nèi)對淀粉酶具有激活作用，以K+激活作用最顯著[20]。通過對不同清液回配比例發(fā)酵成熟醪殘?zhí)菍Ρ龋ㄒ姳?）可知，添加清液后，成熟醪殘總糖在2.03 %～2.16%之間，遠(yuǎn)低于清液0%回配實驗組的2.48%，而不同清液回配量實驗組之間，殘總糖的增加并不明顯。主要原因是清液內(nèi)含有少量游離的金屬離子，促進(jìn)了淀粉酶的作用，使得經(jīng)淀粉酶作用后的液化醪更易被糖化酶分解；隨著清液回配而少量增長的殘總糖主要是由于清液攜帶所致。

表4 不同清液回配比例實驗發(fā)酵殘?zhí)菙?shù)據(jù) (%)

2.2 清液連續(xù)回配影響分析

2.2.1 清液連續(xù)回配對液化的影響分析

實驗結(jié)果表明（見圖3），隨著回配實驗輪次的增加，液化醪酸度呈逐步上升趨勢，其中清液30%比例回配實驗組五輪實驗后，酸度上升了91.49%，清液50 %比例回配實驗組五輪實驗后，酸度上升了115.91%，酸度上升更為明顯。液化醪酸度升高主要是由于發(fā)酵中產(chǎn)生的琥珀酸、乳酸、丙酸、檸檬酸等各種有機(jī)酸均為可溶物，在離心分離過程中被留在了清液中，清液回配過程中重新帶入了系統(tǒng)。

圖3 清液連續(xù)回配實驗液化醪酸度對比

2.2.2 清液連續(xù)回配對發(fā)酵的影響分析

清液中含有乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸等多種有機(jī)酸，從國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)，不同的有機(jī)酸在不同濃度下均會對酵母菌產(chǎn)生抑制作用[21-25]。實驗結(jié)果表明（見表5、圖4），五輪清液回配發(fā)酵后，清液30 %回配實驗組成熟醪殘總糖略微降低，酒精度含量略有增長，相反，清液50 %回配實驗組成熟醪殘總糖略微增長，酒精度含量略有降低。清液攜帶的有機(jī)酸在回配的過程中在醪液內(nèi)不斷積累，當(dāng)回配濃度達(dá)到50%時，醪液內(nèi)積累的有機(jī)酸超過了酵母菌產(chǎn)生抑制作用的臨界濃度，導(dǎo)致成熟醪酒精度降低。

圖4 清液連續(xù)回配實驗發(fā)酵成熟醪酒精度對比

表5 清液連續(xù)回配實驗發(fā)酵殘總糖對比

3 結(jié)論

清液內(nèi)含有低分子肽以及氮、磷、鉀等礦物質(zhì)和生長因子，有助于提升淀粉酶作用效果，改善了酒母繁殖、發(fā)酵能力，提高了原料的利用率；清液回配比例的增加會導(dǎo)致液化醪粘度升高，造成攪拌、輸送、換熱等設(shè)備負(fù)荷提高，增加生產(chǎn)能耗；清液內(nèi)含有各類有機(jī)酸，在清液高比例連續(xù)回配的條件下，會大量積累有機(jī)酸導(dǎo)致酵母受抑制。因此，建議以30%的比例回配清液進(jìn)行酒精發(fā)酵。