樊斐，張國(guó)軍，康熙雄，翟燕紅

·技術(shù)與方法·

微流控芯片免疫分析抗體固定方法比較

樊斐，張國(guó)軍，康熙雄，翟燕紅

化學(xué)分析設(shè)備微型化領(lǐng)域或微流控分析系統(tǒng)，也稱為“微全分析系統(tǒng)（μTAS）或芯片實(shí)驗(yàn)室（LOC）”，目前已受到廣泛關(guān)注［1-2］。20世紀(jì)中期，在微流控芯片上建立的一種新型分析平臺(tái)［3］，目前已被廣泛應(yīng)用在生物研究的各個(gè)領(lǐng)域［3］，例如細(xì)胞培養(yǎng)［4-5］、單細(xì)胞檢測(cè)［6］、基因分析［7-8］和免疫分析［9-10］。近年來(lái)，微流控技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，尤其是在免疫分析方面，比如對(duì)于蛋白質(zhì)的檢測(cè)等。但是，在研究中我們發(fā)現(xiàn)抗體在微流芯片基底表面的固定是影響微芯片免疫分析的關(guān)鍵因素之一，不僅要求目標(biāo)蛋白能高效固定，同時(shí)要求固定后的目標(biāo)蛋白能夠較好地保持原有的生物活性，能夠高效地捕捉靶蛋白。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，抗體在微芯片載體表面的固定是后續(xù)實(shí)驗(yàn)完成的基礎(chǔ)，決定著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。因此，本文通過(guò)對(duì)兩種不同的抗體固定方法進(jìn)行比較研究，分析利弊，以為相關(guān)研究者提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

甲胎蛋白（AFP）單克隆抗體、AFP標(biāo)準(zhǔn)品和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的AFP抗體購(gòu)自北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司；HRP化學(xué)發(fā)光底物液為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；聚二甲基硅氧烷（PDMS）基本組分和固化劑為美國(guó)Dow Corning公司產(chǎn)品；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白（BSA）購(gòu)于德國(guó)Merck公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；微流控成像儀為國(guó)家科學(xué)納米中心產(chǎn)品；晶芯SmartArrayer-48點(diǎn)樣儀為生物芯片北京國(guó)家工程研究中心產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片的制備本研究中所用的微流芯片為7個(gè)通道。先通過(guò)機(jī)械加工法制作微流通道的模具，然后用模塑法翻模制備微流通道，具體步驟如下：先將PDMS基本組分和固化劑以10∶1的比例混合，真空抽氣使浮在表面上的氣泡破裂。將抽氣后的混合物澆鑄在模具上放到80℃烘箱中25 min，冷卻后移去固化的PDMS層，再用帶針的注射器在PDMS層上打孔以得到通道的進(jìn)樣孔，使用不同尺寸的模具，即可獲得相應(yīng)尺寸的微流通道。

1.2.2 微流控芯片檢測(cè)AFP根據(jù)夾心免疫分析的原理，首先在微通道內(nèi)加入AFP抗體并固定，然后揭去通道并在與所固定的抗體條帶垂直的方向上鋪另一個(gè)通道，每個(gè)通道通入20 μl 3%BSA封閉非特異性位點(diǎn)，接著向每一通道中加入20 μlAFP標(biāo)準(zhǔn)品與基底表面過(guò)量的AFP抗體反應(yīng)，最后一個(gè)通道作為空白對(duì)照，常溫下孵育30 min，那么在兩通道交叉的方向上就會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，通入PBS清洗去除未結(jié)合的抗體和抗原。每個(gè)通道加入20 μl HRP-AFP抗體，常溫下孵育30 min，即形成夾心免疫復(fù)合物。清洗之后，去除微流通道并在PDMS基底上反應(yīng)區(qū)域加上化學(xué)發(fā)光底物，然后放入微流控成像儀檢測(cè)。因?yàn)閺?fù)合物中酶的含量與樣本中AFP含量正相關(guān)，所以根據(jù)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度即可定量測(cè)定AFP。

1.2.3 不同尺寸微流通道的比較微流通道的尺寸對(duì)微芯片免疫分析的影響是不容忽視的，所以首先需要選擇用于微芯片免疫分析最合適的尺寸。我們采用機(jī)械加工方法分別制作出高度和寬度皆為100、300、500、800 μm的微流通道模具，再經(jīng)翻模得到相應(yīng)尺寸的微流通道。將各尺寸微流通道與PDMS基底緊密貼合，其余實(shí)驗(yàn)步驟按方法1.2.2進(jìn)行，AFP濃度依次為400、200、100、50、25、12.5 ng/ml，最后分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出最適合的微流通道尺寸。

1.2.4 基于微流通道固定抗體的試驗(yàn)將得出的最佳尺寸的微流通道固定在PDMS基底上，從進(jìn)樣孔分別加入20 μl濃度為40 μg/ml的AFP抗體，室溫孵育30 min后吸出，清洗1次，去除上層微通道，待基底干透后，按方法1.2.2進(jìn)行抗原檢測(cè)，檢測(cè)AFP濃度為50 ng/ml，HRP-AFP抗體以1∶200稀釋，其他條件不變。

1.2.5 基于點(diǎn)樣法固定抗體的試驗(yàn)將AFP抗體用點(diǎn)樣緩沖液稀釋到40 μg/ml，取10 μl加入到384孔板中，用晶芯SmartArrayer-48點(diǎn)樣儀在PDMS基底表面按照預(yù)先設(shè)定好的模式進(jìn)行點(diǎn)樣。模式1：用d=120 μm的點(diǎn)樣針進(jìn)行連續(xù)點(diǎn)樣，同一陣列內(nèi)各點(diǎn)間距為120 μm，各陣列左右間距為4 mm，上下間距為2 mm；模式2：用d=300 μm的點(diǎn)樣針進(jìn)行單點(diǎn)點(diǎn)樣，點(diǎn)間距為2 mm。室溫固定30 min后，將基底與微通道黏結(jié)后，按方法1.2.2進(jìn)行抗原檢測(cè)，AFP濃度依次為400、200、100、50、25、12.5 ng/ml，分別加入到每一通道內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，HRP-AFP抗體以1∶200稀釋，其他條件不變。

2 結(jié)果

2.1 微流通道尺寸篩選

結(jié)果表明，寬度為100 μm微流通道檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)明顯信號(hào)（圖1A）。雖然通過(guò)延長(zhǎng)曝光時(shí)間可見(jiàn)到一些發(fā)光點(diǎn)，但亮度極暗，而且曝光時(shí)間延長(zhǎng)，使發(fā)光液顯現(xiàn)出來(lái)，導(dǎo)致背景值極高，對(duì)比度不顯著；寬度為300 μm微流通道檢測(cè)結(jié)果信號(hào)區(qū)域窄，均一性相對(duì)較差，而且有些檢測(cè)點(diǎn)未出現(xiàn)信號(hào)（圖1B），同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，微流通道尺寸過(guò)細(xì)不僅增加了加樣難度，而且容易出現(xiàn)漏液的現(xiàn)象；寬度為500 μm微流通道的檢測(cè)結(jié)果顯示，所有陽(yáng)性點(diǎn)均可檢測(cè)到發(fā)光，信號(hào)區(qū)域大小適中并且與背景的對(duì)比度明顯，實(shí)驗(yàn)也未出現(xiàn)漏液的現(xiàn)象（圖1C）。如果再增加微通道寬度至800 μm，則不僅樣品和試劑的消耗量增加，而且還需要增加清洗次數(shù)。由此認(rèn)為，寬度為500 μm的微流通道為最佳選擇。

2.2 點(diǎn)樣法與微流通道法的比較

雖然點(diǎn)樣方法具有批量包被的優(yōu)勢(shì)，但是圖2結(jié)果說(shuō)明此方法芯片內(nèi)變異較大，信號(hào)均一性較差，信號(hào)強(qiáng)度隨抗原濃度增高而遞增的規(guī)律性不明顯，而且還需要將微流通道對(duì)準(zhǔn)所固定的抗體，使得操作復(fù)雜。圖3說(shuō)明采用微流通道方法固定抗體變異較小，信號(hào)區(qū)域大小適中，結(jié)果較穩(wěn)定，更適合用于微流控芯片免疫分析。但是，采用這樣的固定方法一次性包被量少，不適合批量進(jìn)行，因此還需要進(jìn)一步改善。

圖1 四種通道尺寸的標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)發(fā)光檢測(cè)成像圖片比較（A：100 μm；B：300 μm；C：500 μm；D：800 μm）

圖2 基于點(diǎn)樣法固定抗體的結(jié)果

圖3 基于微流通道法固定抗體的結(jié)果

3 討論

微流控芯片在世界范圍屬于分析技術(shù)的前沿，其在疾病診斷領(lǐng)域所具有的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景被分析化學(xué)科研界以及臨床診斷和科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)界所認(rèn)可，尤其是在免疫分析方面。盡管微流免疫分析系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室獲得了比較好的結(jié)果，但要完全產(chǎn)業(yè)化還需要更多的努力，還需對(duì)芯片制造、表面修飾、抗體的固定、集成檢測(cè)及免疫化學(xué)反應(yīng)等技術(shù)進(jìn)行組合優(yōu)化。

近年來(lái)人們嘗試了各種載體和修飾方法，并對(duì)抗體在這些載體上的固定進(jìn)行了研究，然而迄今為止還沒(méi)有一種能同時(shí)滿足不同要求的抗體固定技術(shù)。本研究分析了微流通道尺寸對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)AFP抗體在微流控芯片固相載體表面的固定方法進(jìn)行了優(yōu)化。理想的抗體固定應(yīng)具備以下特點(diǎn)：維持抗體結(jié)構(gòu)完整，使其保持與抗原結(jié)合的能力；不同批次芯片之間以及同一芯片上各點(diǎn)應(yīng)整齊均一；非特異性吸附較小、信噪比高；抗體有較長(zhǎng)的保質(zhì)期。從本研究的結(jié)果來(lái)看，采用微流通道進(jìn)行抗體固定時(shí)，各信號(hào)整齊均一，芯片內(nèi)變異較小，而且非特異性吸附較小、信噪比高，相比點(diǎn)樣法更適合用于微流控芯片免疫分析。所以在后續(xù)的研究中可以采用微流通道的方法進(jìn)行抗體固定，但是下一步需要對(duì)此方法進(jìn)行改進(jìn)，以便于批量包被，這樣更有利于產(chǎn)業(yè)化，有助于更廣泛地應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)研究、新藥開(kāi)發(fā)、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷等研究領(lǐng)域。

［1］Gómez R，Bashir R，Sarikaya A，et al.Microfluidic biochip for impedance spectroscopy of biological species.Biomed Microdevices，2001，3（3）：201-209.

［2］Arora A，Simone G，Salieb-Beugelaar GB，et al.Latest developments in micro total analysis systems.Anal Chem，2010，82（12）：4830-4847.

［3］HuangH，ZhengXL，ZhengJS，etal.Rapidanalysisof alpha-fetoprotein by chemiluminescence microfluidic immunoassay systembasedonsuper-paramagneticmicrobeads.Biomed Microdevices，2009，11（1）：213-216.

［4］Tourovskaia A，F(xiàn)igueroa-Masot X，F(xiàn)olch A.Differentiation-on-a-chip：a microfluidic platform for long-term cell culture studies.Lab Chip，2005，5（1）：14-19.

［5］Zió?kowska K，Stelmachowska A，Kwapiszewski R，et al.Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.Biosens Bioelectron，2013，40（1）：68-74.

［6］Hou S，Zhao L，Shen Q，et al.Polymer nanofiber-embedded microchips for detection，isolation，and molecular analysis of single circulating melanoma cells.Angewandte Chemie Int Ed，2013，52（12）：3379-3383.

［7］Ferguson BS，Buchsbaum SF，Wu TT，et al.Genetic analysis of H1N1 influenza virus from throat swab samples in a microfluidic system for point-of-care diagnostics.JAm Chem Soc，2011，133（23）：9129-9135.

［8］Pan X，Jiang L，Liu K，et al.A microfluidic device integrated with multichamber polymerase chain reaction and multichannel separation for genetic analysis.Anal ChimActa，2010，674（1）：110-115.

［9］Yang D，Niu X，Liu Y，et al.Electrospun nanofibrous membranes：a novel solid substrate for microfluidic immunoassays for HIV.Adv Mater，2008，20（24）：4770-4775.

［10］Ng AC，Uddayasankar U，Wheeler AR.Immunoassays in microfluidic systems.Anal Bioanal Chem，2010，397（3）：991-1007.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.016

100026北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科（樊斐、翟燕紅）；100050北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心（張國(guó)軍、康熙雄）

翟燕紅，Email：zhaiyanhong2006@126.com

2014-05-20