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      優(yōu)化三個(gè)因素改善血漿蛋白醋酸纖維薄膜電泳效果*

      2020-01-08 22:48:48李雨勤吳永亮黎威巍金科華
      關(guān)鍵詞:訂書點(diǎn)樣濾紙

      姚 蕾,李雨勤,吳永亮,黎威巍,金科華

      (湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北 咸寧 437100)

      血漿蛋白電泳圖譜的類型可為疾病的診斷提供依據(jù),理想的電泳條帶是提供診斷依據(jù)的前提。電泳條帶不清晰,條帶數(shù)量少均導(dǎo)致定量困難,從而無法提供診斷依據(jù)。為此,優(yōu)化影響電泳的因素,提高電泳分離效果十分必要。血漿蛋白醋酸纖維薄膜電泳(簡稱電泳)實(shí)驗(yàn)常用蓋玻片或X光膠片點(diǎn)樣,用pH8.6、離子強(qiáng)度0.06的巴比妥-巴比妥鈉緩沖液電泳[1]。這些點(diǎn)樣材料和緩沖液有不少弊端:首先,血漿在蓋玻片和X光膠片上難以分布均勻,以致無法形成整齊的點(diǎn)樣線,造成電泳條帶數(shù)量少、條帶不清晰、條帶畸形;其次,巴比妥鈉有毒[2],價(jià)格昂貴,不易采購;此外,巴比妥緩沖液電泳分離的條帶間距小,很難得到6條帶,不便于后續(xù)各類蛋白的定量。為此,本研究擬比較點(diǎn)樣材料、磷酸緩沖液緩濃度及點(diǎn)樣量對(duì)電泳效果的影響,確定最佳點(diǎn)樣材料、最適緩沖液濃度和最適點(diǎn)樣量,從而建立理想的電泳體系,為后續(xù)的條帶定量和臨床疾病診斷奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      DYY-6C電泳儀電源、DYCP-38C電泳槽購自北京六一儀器廠;8cm×2cm乙酸纖維素薄膜(簡稱薄膜)為路橋四甲生化塑料廠產(chǎn)品;30cm×30cm雙圈牌濾紙為杭州沃華濾紙有限公司產(chǎn)品;No.0015厚層訂書為得力集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

      分析純Na2HPO4、KH2PO4分別為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司、廣東西隴化工廠產(chǎn)品;氨基黑、無水乙醇為國藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;無水甲醇為廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心產(chǎn)品;冰乙酸為天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品。據(jù)劉漢才的方法[3]配制pH8.67 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(簡稱緩沖液);按孫聰?shù)姆椒╗4]配制染色液、漂洗液。

      抽取本文作者吳永亮靜脈血15mL,分裝于含枸櫞酸鈉的抗凝管,4℃4000r/min離心10min,取上層血漿小份分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2 薄膜的準(zhǔn)備與搭橋

      將薄膜糙面朝下逐條放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中,用鑷子輕壓薄膜的表面,使其浸泡在緩沖液中30min以上。取出浸泡的薄膜,置于緩沖液潤濕的濾紙上[5],吸取多余的水分[6]。向電解槽的正負(fù)極加等高的緩沖液[7]。用雙層濾紙搭橋,濾紙與槽緊貼,無氣泡,表面平整。

      1.3 點(diǎn)樣、平衡及電泳

      將浸泡好的薄膜置于潤濕的濾紙上,用三種材料點(diǎn)樣。①濾紙條點(diǎn)樣。將濾紙裁剪成1cm×1mm的小條,用緩沖液潤濕,貼于薄膜點(diǎn)樣處(距一端約2cm,下同),用移液器取血漿均勻涂布于濾紙條上。點(diǎn)樣完畢,用紙巾吸取薄膜下濾紙的水分,使血漿加速滲入薄膜內(nèi)。②火車票點(diǎn)樣。將磁質(zhì)火車票橫向裁成寬1cm的條,用移液器取血漿均勻涂布于火車票1cm的橫截面,將火車票血漿印于點(diǎn)樣處。③訂書釘點(diǎn)樣。用橡皮擦固定訂書釘?shù)膬啥?,將血漿均勻涂布于訂書釘上,再將血漿印于點(diǎn)樣處。薄膜點(diǎn)樣端置于電泳槽負(fù)極,粗面向下,平整垂直地貼于濾紙橋上,平衡5~15min[8],110V電泳40min。

      1.4 染色與漂洗

      電泳后的薄膜放入染色液中染色10min,取出薄膜于漂洗液中連續(xù)漂洗數(shù)次,直至條帶清晰,背景干凈。

      1.5 探索最佳點(diǎn)樣材料

      取2μL血漿,按1.3分別用濾紙條、火車票和訂書釘點(diǎn)樣,在0.25×的緩沖液中電泳,比較不同點(diǎn)樣材料分離的條帶數(shù)量和清晰度,確定最佳點(diǎn)樣材料。

      1.6 探索最佳緩沖液濃度

      將1×緩沖液依次稀釋2倍(0.5×)、3倍(0.33×)、4倍(0.25×)、5倍(0.2×),用最佳點(diǎn)樣材料點(diǎn)樣2μL血漿,分別在不同稀釋倍數(shù)的緩沖液中電泳,比較分離的條帶數(shù)量和清晰度,確定最佳緩沖液濃度。

      1.7 探索最佳點(diǎn)樣量

      分別取0.5、1、2、3、4μL血漿,用最佳點(diǎn)樣材料點(diǎn)樣,在最佳濃度的緩沖液中電泳,比較分離的條帶數(shù)量和清晰度,獲得最佳點(diǎn)樣量。

      2 結(jié) 果

      2.1 濾紙條點(diǎn)樣電泳效果最好

      濾紙條、火車票和訂書釘點(diǎn)2μL血漿的薄膜,用0.25×緩沖液電泳,結(jié)果見圖1(封二),由圖可知膜a、b均有6條帶;但膜b中的條帶拖尾明顯;膜c只見顏色較淺的5條帶。由此認(rèn)為濾紙條點(diǎn)樣效果最好。

      2.2 0.5×緩沖液電泳效果最好

      用濾紙條點(diǎn)2μL血漿的薄膜,在1×、0.5×、0.33×、0.25×、0.2×緩沖液中電泳結(jié)果見圖2(封二)。由圖可知,膜b、c、d上均有6條帶;膜a只見5條帶,且間距短,條帶重疊;膜e只見4條帶,且條帶很淡。隨著緩沖液濃度降低,條帶間距增大,條帶拖尾愈明顯。0.5×緩沖液的結(jié)果條帶間距適中、清晰度最佳。

      2.3 2μL血漿電泳效果最好

      用濾紙條分別點(diǎn)0.5、1、2、3、4μL血漿,行0.5×緩沖液電泳,結(jié)果見圖3(封二)。由圖可知,膜b、c、d、e均有6條帶;而膜a只見5條帶,且條帶很淡;隨點(diǎn)樣量增多,條帶顏色逐漸加深,拖尾現(xiàn)象愈發(fā)明顯。點(diǎn)2μL血漿的薄膜電泳條帶顏色及間距適中,清晰度最佳。

      3 討 論

      文獻(xiàn)報(bào)道巴比妥緩沖液在離子強(qiáng)度為0.06~0.09時(shí)血清電泳效果較好[6],而本研究發(fā)現(xiàn)稀釋兩倍的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液電泳效果最好,其離子強(qiáng)度為0.098,超過上述最適離子強(qiáng)度范圍的上限。為此,我們推測(cè)電泳緩沖液最適離子強(qiáng)度可能因緩沖液種類不同而異。此外,本研究發(fā)現(xiàn)緩沖液最適離子強(qiáng)度由電泳血漿所得,與文獻(xiàn)電泳血清有所不同,最適緩沖液離子強(qiáng)度是否因電泳材料不同而異需要進(jìn)一步研究。

      冀華等[9]發(fā)現(xiàn)訂書釘點(diǎn)樣的血清電泳后各蛋白質(zhì)條帶無明顯拖尾和擴(kuò)散現(xiàn)象,而本文發(fā)現(xiàn)訂書釘點(diǎn)樣的血漿電泳后僅有5條帶,且條帶很淡。訂書釘和磁質(zhì)火車票吸水性差,單次承載的最大血漿量分別為0.5和0.8μL,2μL血漿須多次點(diǎn)樣才能完成,多次點(diǎn)樣易導(dǎo)致點(diǎn)樣點(diǎn)偏移,從而導(dǎo)致電泳效果不佳。

      本研究有三大創(chuàng)新:一是用濾紙條點(diǎn)樣;二是磷酸緩沖液替代有毒的巴比妥緩沖液;三是確定最佳緩沖液濃度。用濾紙條點(diǎn)樣可固定點(diǎn)樣點(diǎn),控制點(diǎn)樣量,獲得均勻、整齊的點(diǎn)樣線,電泳條帶更清晰;配制磷酸緩沖液所需試劑廉價(jià)、無毒,易于購買;稀釋緩沖液既能改善電泳效果,又能減少試劑用量、降低實(shí)驗(yàn)成本。

      綜上所述,本研究優(yōu)化了血漿醋酸纖維薄膜電泳的三個(gè)因素:最佳點(diǎn)樣材料為濾紙條,最佳緩沖液濃度為0.5×緩沖液,最佳點(diǎn)樣量為2μL。實(shí)驗(yàn)建立了理想的電泳體系,為基于血漿蛋白電泳條帶定量的疾病診斷提供了可靠的技術(shù)保障。

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