朱華英，朱麗，徐玲娣，陳廷美，劉頌平

·論著·

Th17細胞相關因子在子癇前期和正常妊娠孕婦外周血和胎盤中表達量的對比

朱華英，朱麗，徐玲娣，陳廷美，劉頌平

目的 通過對子癇前期及正常妊娠的孕婦外周血及胎盤組織中 Th17 細胞相關因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G 及RORc 表達量的檢測以及 miRNA-21 相對表達量的比較，探討 Th17 細胞相關因子以及 miRNA-21 在子癇前期發(fā)病中的作用。

方法 選取 2012年3月至 2014年5月鎮(zhèn)江婦幼保健院的 40 例孕婦為研究對象，其中子癇前期孕婦 20 例，正常孕婦 20 例，采用流式細胞儀分別檢測子癇前期組和正常對照組外周血中 Th17 細胞的水平，采用實時定量 PCR 法檢測外周血和胎盤組織中 Th17 細胞相關細胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 的表達量和相對表達量，采用實時定量 PCR 法檢測胎盤組織中 miRNA-21 的相對表達量。

結果 初步證實子癇前期患者和正常妊娠女性外周血Th17 細胞相關細胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平之間存在差異，子癇前期患者和正常妊娠女性胎盤組織中 Th17 細胞相關細胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、RORc、HLA-G 水平存在差異。⑴子癇前期患者的 IL-17、IL-21、IL-22的相對表達量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。⑵子癇前期組的 HLA-G、RORc 的相對表達量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。⑶子癇前期組的 miRNA-21 的相對表達量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。⑷各項指標之間及各檢測指標與臨床指標間存在相關性。

結論 Th17 細胞相關細胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平在子癇前期的發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用，通過對相關指標的監(jiān)測可能預測子癇前期的發(fā)生和監(jiān)測病情變化，阻斷這一途徑就有可能有效預防和治療子癇前期。

子癇前期；Th17 細胞；實時聚合酶鏈反應

懷孕前血壓正常的孕婦在妊娠 20 周以后出現高血壓、蛋白尿的一類免疫系統(tǒng)疾病稱為子癇前期［1］。子癇前期可伴有全身多臟器的損害，嚴重者出現胎盤早剝，彌漫性血管內凝血，甚至死亡，母嬰健康受到嚴重影響［2］。在全球范圍內，有 5%～14% 的孕婦患有子癇前期。在發(fā)展中國家中，子癇前期的發(fā)病率也高達 4%～18%［3］。子癇前期也成為孕產婦和圍生兒發(fā)病及死亡的主要原因之一［4］。有報道稱 Th17 細胞在免疫調控方面具有重要的研究基礎和臨床應用價值［5-6］。同時 miRNA 家族可能在促進子癇前期的發(fā)病方面“功不可沒”［7-8］。但目前子癇前期的發(fā)病機制尚未闡明。所以本文針對 Th17 細胞分泌的 IL-17、IL-21、IL-22、RORc 以及 HLA-G 進行 PCR 定量檢測，同時對 miRNA-21也進行了檢測，希望從這些結果對比中找到子癇前期發(fā)病的原因，為未來子癇前期的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象和材料

選取 2012年3月至 2014年5月鎮(zhèn)江婦幼保健院的 40 例孕婦為研究對象，其中子癇前期組孕婦 20 例（年齡：28.5 ± 2.2 歲），正常對照組孕婦 20 例（年齡：27.85 ± 3.0 歲）。兩組孕產婦孕前均無高血壓、心臟病、腎病、糖尿病、血小板減少等病史。子癇前期確診標準參照《婦產科學》［9］：BP ≥ 160/110 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa）；尿蛋白 ≥ 2.0 g/24 h 或定性試驗 ≥（++）；血清肌酐 ＞106μmol/L，除非以前就已有升高；血小板 ＜ 100 × 109/L；毛細血管病性溶血（LDH 升高）；ALT 或AST 升高；持續(xù)性頭痛或其他大腦或視覺障礙；持續(xù)性上腹痛。詳細記錄孕產史、自覺癥狀、血壓、尿蛋白、胎盤重量、新生兒體重、Apgar 評分等情況。兩組孕婦均簽知情同意書。

表1 一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data

試劑盒（FP401）購自日本 Toyobo 公司；Denley dragon Wellscan MK 3 酶標儀為芬蘭Thermo 公司產品；TGL-168 型離心機為上海安亭科學儀器廠產品。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

⑴血標本采集：產前采兩組產婦的外周肘靜脈血，取 0.5 ml 注入肝素無菌管中，8 h 內送流式細胞儀檢驗 Th17 細胞百分比。產前采兩組產婦外周肘靜脈血置于無菌 EP 管中，保存于 -80 ℃ 冰箱待 PCR 成批檢測。

⑵胎盤采集：胎盤娩出后避開鈣化灶，于胎盤正中母體面取下胎盤組織 l cm × l cm × l cm，經無菌生理鹽水反復漂洗后置于無菌 EP 管中，保存于-80 ℃ 冰箱待 PCR 成批檢測。

1.2.2 流式細胞儀檢測兩組產婦外周血中以IL-17+為特征的 Th17 細胞所占百分比 將兩組孕婦的外周血抽取 0.5 ml 注入肝素無菌管中，標記 CD8-FITC 單克隆抗體和 CD3-APC 單克隆抗體，濃度稀釋 1∶200，室溫孵育 15 min。PBS 洗滌 2 次。通過流式細胞儀檢測出以 IL17+為特征的 Th17 細胞在外周血中所占百分比。

1.2.3 PCR 技術檢測兩組絨毛和蛻膜中目的基因IL-17、IL-21、RORc 及 HLA-G 表達量 Tiangen Biotech 提取細胞總 RNA，按說明書操作。逆轉錄合成 cDNA，于 -20 ℃ 保存。采用 ABI 7500 PCR系統(tǒng)及 SYBRgreen I 染料法進行熒光定量 PCR 檢測，采用 β-actin 作為內參照。所用引物由試劑公司設計合成，PCR 條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 1 min，共 35 個循環(huán)。

1.2.4 PCR 技術檢測兩組胎盤組織 miRNA-21的相對表達量 Tiangen Biotech 提取胎盤組織總RNA，按說明書操作。逆轉錄合成 cDNA，于 -20 ℃保存。采用 U6 RNA 作為內參照。所用引物由試劑公司設計合成。熒光定量 PCR 條件設置如下：95 ℃ 預變性 15 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 60 s，進行 35 個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 臨床一般資料比較

子癇前期組和正常對照組孕婦的年齡差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05），但兩組孕婦的孕周及新生兒體重差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。一般臨床資料比較見表1。

2.2 外周血中 Th17 細胞代表因子 IL-17+水平比較

子癇前期組外周血中 IL-17+表達水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01），且孕周不影響 IL-17+表達（P ＜ 0.05）（圖1）。

圖1 正常對照組和子癇前期組外周血中 Th17 細胞代表因子 IL-17+流式結果對比圖（*P ＜ 0.05）Figure 1 Comparison of IL-17+flow cytometry results between the control group and the pre-eclampsia group （*P ＜0.05）

2.3 胎盤及外周血中 IL-17、IL-21 表達量的比較

子癇前期組胎盤和外周血中 IL-17、IL-21 的表達量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）（圖2）。

圖3 正常對照組和子癇前期組胎盤組織中 RORc（A）和 HLA-G（B）表達量對比檢測（**P ＜ 0.01）Figure 3 Comparison of the RORc（A） and HLA-G（B） expression levels in the control group and the pre-eclampsia group （**P ＜0.01）

2.4 胎盤中 RORc 和 HLA-G 的表達量的比較

胎盤中，子癇前期組的 RORc 和 HLA-G 的表達量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）（圖3）。

2.5 外周血中 Th17 細胞相關因子相對表達水平比較

子癇前期組外周血中 IL-17、IL-21、IL-22的相對表達量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.001）（圖4）。

2.6 胎盤組織中 Th17 細胞相關因子相對表達水平比較

子癇前期組胎盤中 IL-17 和 IL-21 的表達量明顯高于正常對照組，而 RORc 和HLA-G 表達量則低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）（圖5）。

2.7 胎盤組織中 miRNA-21 相對表達水平比較

圖4 正常對照組和子癇前期組外周血 Th17 相關因子IL-17、IL-21 及 IL-22 相對表達量對比圖（***P ＜ 0.001）Figure 4 Comparison of the expression levels of Th17-associated cytokines IL-17， IL-21 and IL-22 in peripheral blood （***P ＜ 0.001）

子癇前期組胎盤中 miRNA-21 相對表達量明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）（圖6）。

3 討論

Th17 細胞是一種新型的 CD4+效應細胞，在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要的意義。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現，Th17 細胞在類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病等自身免疫性疾病中發(fā)揮著至關重要的作用［10］。妊娠其實就是母體對胎兒的免疫耐受調節(jié)的炎癥反應過程，因此我們大膽推測 Th17 細胞在子癇前期的發(fā)病過程中可能發(fā)揮著一定作用。本文研究結果顯示Th17 細胞分泌的 IL-17、IL-21、IL-22、RORc 以及 HLA-G 相關因子在子癇前期組和正常對照組之間存在明顯的差異。IL-17、IL-21、IL-22 在子癇前期組中表達量明顯高于正常對照組，可以看出子癇前期組 IL-17、IL-21、IL-22 釋放量增加。而RORc 和 HLA-G 在子癇前期組中表達量明顯低于正常對照組，可以看出子癇前期組 RORc 和HLA-G 釋放被抑制。通過研究結果可以提示子癇前期的發(fā)病與 Th17 細胞釋放的相關炎性因子有著很大的關系。

miRNA 家族是一類非編碼 RNA，長約 22 個核苷酸，通過與靶基因 mRNA 的 3' 端非翻譯去相互作用，從而調控靶基因的表達，進而廣泛作用于生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生、衰老凋亡、免疫應答等各種生物學過程［7］。本文研究結果顯示，miRNA-21 在子癇前期組和正常對照組之間存在差異，miRNA-21在子癇前期組中釋放量增加，說明 miRNA-21 與子癇前期的發(fā)病呈正相關，通過研究結果提示miRNA-21 參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程。

圖6 正常對照組和子癇前期組胎盤組織中 miRNA-21 相對表達量對比圖（**P ＜ 0.01）Figure 6 Comparison of the miRNA-21 expression level in placenta tissues in the control group and pre-eclampsia group（**P ＜ 0.01）

本研究通過比較正常對照組和子癇前期組各類炎癥因子指標數值，我們發(fā)現在子癇前期患者體內 IL17、IL21 的表達增加，ROR、HLA-G 的表達降低，miRNA-21 的表達增加。這一結果對于臨床檢測具有指導性意義。說明子癇前期組的免疫反應比正常對照組要明顯，并且可能由于 HLA-G 的降低，子癇前期組更容易早產。ROR 表達的降低以及 miRNA-21 表達的升高說明了子癇前期患者體內細胞致瘤性比正常對照組大大增加。通過對相關指標的監(jiān)測可預測子癇前期的發(fā)生和監(jiān)測病情變化，阻斷這一途徑從而達到有效預防和治療子癇前期的目的。早期診斷和早期干預將極大提高該病患者的生活質量，節(jié)約醫(yī)療資源，其社會經濟效應意義重大深遠。

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Methods This case-control study was conducted on 40 pregnant women. This comprised 20 women with pre-eclampsia and 20 healthy， age-matched pregnant women （controls）. Expression of IL-17， IL-21， RORc， HLA-G and miRNA-21 in placenta and peripheral blood were measured by flow cytometry （FCM）， ELISA and polymerase chain reaction （PCR）.

Results It was confirmed that patients with pre-eclampsia and normal pregnancy women showed different expressions of IL-17，IL-21， RORc and HLA-G associated with Th17 cells in peripheral blood and placenta as follows. （1） Expressions of IL-17 and IL-21 in patients with pre-eclampsia were higher than those in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （2）Expressions of RORc and HLA-G in patients with pre-eclampsia were lower than those in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （3） Expression of miRNA-21 in patients with pre-eclampsia was higher than that in healthy women. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）. （4） These data have correlation with clinical indicators. The difference was statistically significant （P ＜ 0.05）.

Conclusion Expressions of IL-17， IL-21， RORc and HLA-G associated with Th17 cells play an important role in pre-eclampsia. Through monitoring relevant indicators， the occurrence of pre-eclampsia might be predicted and monitored for the change of condition. Through early diagnosis and intervention along with safe and effective treatment， the quality of patient lives with pre-eclampsia could be greatly improved， thus saving more medical resources.

Comparison of expression levels of Th17-associated factors in placenta and peripheral blood between women with pre-eclampsia and healthy women

ZHU Hua-ying， ZHU Li， XU Ling-di， CHEN Ting-mei， LIU Song-ping

Objective To study the relationship between Th17 cells and relative factors with pregnancy-induced hypertension disease， we compared the expression of relative factors of Th17 cells in placenta and peripheral blood from women with pre-eclampsia and healthy women.

Pre-eclampsia；Th17 cells；Real-time polymerase chain reaction

XU Ling-di， Email： 25813211928@qq.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.06.012

江蘇省衛(wèi)生廳重大項目（H201249）

212000 鎮(zhèn)江市，江蘇大學附屬第四人民醫(yī)院（鎮(zhèn)江市婦幼保健院）婦產科（朱華英、徐玲娣、陳廷美、劉頌平）；212013 鎮(zhèn)江市，江蘇大學醫(yī)學院（朱麗）

徐玲娣，Email：25813211928@qq.com

2015-08-19

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2015, 10(6):528-532

Author Affiliations： The 4th People′s Hospital Affiliated to Jiangsu University， Jiangsu University Medical College， Zhenjiang 212000， China （ZHU Hua-ying， XU Ling-di， CHEN Ting-mei， LIU Song-ping）； School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China （ZHU Li）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2015, 10(6):528-532