劉星，孔建強

·綜述·

催化甾體羥基化的P450氧化酶BM3的蛋白質(zhì)工程的研究進展

劉星，孔建強

甾體關鍵位點的羥基化在藥用甾體的合成中發(fā)揮重要作用。為探究細胞色素 P450（CYP450）氧化酶 BM3 在甾體羥基化合成中的潛在應用，基于細胞色素 P450 BM3 的蛋白質(zhì)工程逐漸發(fā)展起來。在取得的若干 P450 BM3 突變酶的基礎上，通過新一代測序技術和生物信息學分析等方法，篩選出催化甾體羥基化的相關 CYP450。根據(jù)易錯 PCR等定向進化技術獲得了突變位點信息，進一步采用（飽和）定點突變等進化技術對活性氨基酸位點進行分析，再經(jīng)過篩選獲得既高于親本酶也高于易錯 PCR 技術得到的突變酶活力的新突變酶，并對突變體進行功能驗證，進一步闡明甾體羥基化的可行性和重要性。此外，P450 BM3 催化底物和生成產(chǎn)物的選擇性可以通過迭代的組合活性位點突變而改變。本文旨在探究近年來科研人員在 P450 氧化酶 BM3蛋白質(zhì)工程催化甾體羥基化的改良領域中所做的嘗試、獲得的成果以及存在的問題，為 P450 BM3 羥基化疏水性甾體的深入研究提供理論依據(jù)。

1 概述

甾體藥物在醫(yī)藥領域中占有重要地位，是僅次于抗生素的第二大類藥物［1］，具有很強的抗過敏、抗感染、抗病毒等藥理活性。除了薯蕷皂苷元在甾體藥物中的廣泛應用外，一些甾醇如膽固醇、谷甾醇和菜籽甾醇等現(xiàn)在也被認為是具有巨大潛能的甾體激素類藥物的起始原料。CYP450 酶在甾體激素生物合成及代謝清除過程中起關鍵作用，而甾體激素也可影響 P450 酶的表達及代謝活性［2］。

眾所周知，甾體激素結構的微小變化，例如甾體母核的氧化狀態(tài)，附加的官能團的類型、數(shù)量和立體位置［3］等會嚴重影響它們的生物活性。為了獲得新穎的和更有活性的化合物，人們對甾類化合物進行了大量研究。在這些研究中，羥基化引起了人們越來越高的關注。羥基化增加了疏水性類甾體的極性，且羥基化的甾體通常比非羥基化的甾體具有更高的生物活性。甾體的羥基化主要是運用微生物全細胞催化法［3］，只有少數(shù)是使用分離的酶。細胞色素 P450 單加氧酶超家族是能催化甾體羥基化酶的典型代表，它們具有反應條件溫和、環(huán)境友好、催化效率和選擇性高等優(yōu)勢，能完全滿足化學合成的要求［4-5］。

甾體關鍵部位的羥基化提供了一個有效的獲得珍貴藥物代謝物、天然產(chǎn)物的衍生物和其他重要化合物的途徑［6］。然而，由于 P450 酶的內(nèi)在特性［7］，如需要合適的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)等，還不能進行大規(guī)模工業(yè)應用，但通過蛋白質(zhì)工程得到的細胞色素 P450 BM3 及其突變體已經(jīng)被報道能在不同的位置羥基化甾體。

1.1 CYP450

CYP450 是一類含亞鐵血紅素的單加氧酶，廣泛存在于各類生物體內(nèi)，參與多種外源物質(zhì)的代謝和內(nèi)源物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，如甾類激素、膽汁酸、膽固醇等的代謝。而在人類藥物代謝中起決定作用的主要是 CYP1、CYP2 以及 CYP3 酶亞家族［8］。盡管 CYP450 氨基酸序列的不一致性高達 90%，但是其序列擁有共同的折疊方式［9］。CYP450 酶能夠催化的反應主要有烴類化合物的羥基化或環(huán)氧化，雜環(huán)化合物的氨、氧、硫部位上的脫烷基化等。在真核生物中，這些酶對類固醇的合成和生物轉(zhuǎn)化起著重要作用。而哺乳動物肝臟的CYP450 對許多藥物發(fā)揮重要的解毒作用［10］。雖然這些酶在自然進化中還沒有具備現(xiàn)代化學工業(yè)所需的催化特性，許多CYP450 顯示出寬松的底物特異性，表現(xiàn)為對非天然底物具有一定程度的活性，如應用于一些藥物的開發(fā)［11］。

多數(shù) P450 單加氧酶以膜結合形式存在，其發(fā)揮活性需要依賴復雜的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和昂貴的輔因子，如 NADPH，往往活性較低，且穩(wěn)定性也較差。而 CYP102 家族的細菌性 P450 單加氧酶卻可以克服上述部分難題。例如，來源于巨大芽孢桿菌（Bacillus Megaterium）的 BM3，它是已知的最活躍的一種含血紅素的 CYP450。含血紅素的 P450 單加氧酶可構成一個主要的酶家族，其含有 4500 多個來源于不同物種的成員［12］，并且各成員均以可溶性形式存在，同時具有較高的轉(zhuǎn)化率，推測這可能是由于其 N-末端的血紅素加氧酶結構域和 C 末端的黃素還原酶結構域共價連接所致。此外，含血紅素的 P450 單加氧酶家族的成員還具有獨一無二的功能，即把羥基引入底物的非活性碳上。這一功能具有重要意義，因為在一個特定的底物插入羥基可以顯著影響其生物利用度、生物活性和溶解度［6］?；谥扑幮袠I(yè)和生物技術的需求，目前甾體是科研人員最感興趣的底物之一。盡管 CYP450 的種類不同，所需的電子傳遞系統(tǒng)也不盡相同，但一般可以用以下通式來表示其催化反應：

RH + O2+ NADPH + H+→ ROH + NADP++ H2O

式中 RH 代表底物，在分子氧（O2）參與下底物被 P450催化形成水和羥基化產(chǎn)物（ROH）。其氧化機制見圖1［13-14］。

圖1 CYP450 的催化循環(huán)

1.2 CYP450 BM3

CYP450 BM3 是由細胞色素單加氧酶和依賴 NADPH的 FMN/FAD 還原酶組成的單鏈融合蛋白。它的分子量大約為 119 kD，其中含有兩分子黃素的多肽結構域為 65 kD，血紅素結構域為 55 kD（圖2）［15］。

圖2 BM3 的結構（Heme 為 BM3 的血紅素結構域；FMN 和 FAD 為含兩分子黃素的還原酶結構域；數(shù)字代表氨基酸位點）

CYP450 BM3 能夠?qū)㈡滈L為 C12～C20的飽和脂肪酸的 ω-1、ω-2、ω-3 位羥基化，同時也能催化鏈長為 C12～C20的單不飽和脂肪酸、脂肪醇和脂肪酰胺等，但催化活力不高。此外，BM3 在大腸桿菌中高表達，作為一種血紅素依賴的催化劑參與多種生理過程，如參與藥物和外源性化學物質(zhì)的代謝。系統(tǒng)進化分析表明，P450 BM3（CYP102）與人類主要參與藥物代謝的酶，特別是 P450 3A4［16］具有較高的同源性。

目前，對于 P450 BM3 的研究主要集中在以下幾個方面：①研究催化反應機制與酶結構的關系；②通過蛋白質(zhì)工程增加底物的特異性，提高對底物的催化性能（KM、Kcat和偶聯(lián)效率）及擴大底物作用范圍；③尋找廉價的輔因子和電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)；④開發(fā)高效、精確的高通量篩選方法。

雖然 P450 BM3 是已知的最活躍的 CYP450，但事實上非天然底物往往具有低的 NADPH 消耗率和不良的偶聯(lián)率［17］，這種酶仍然不能像野生型的酶催化它們優(yōu)選的脂肪酸底物那樣有效地催化甾體，野生型酶的效用受到限制。

2 催化甾體羥基化的 P450 氧化酶 BM3 的蛋白質(zhì)工程

定向進化和（飽和）定點突變是蛋白質(zhì)工程的主要研究手段，用以提高酶催化的精確性和有效性，彌補天然酶活性低、穩(wěn)定性差及缺乏商業(yè)利用價值的缺陷。蛋白質(zhì)工程可以幫助人們對目標蛋白進行有目的的改造，因此許多研究希望通過蛋白質(zhì)工程獲得 P450 BM3 羥基化甾醇的催化性能，并且借助新突變酶結構和功能的關系為酶的進一步研究改造提供更多有價值的信息。過去幾年通過蛋白質(zhì)工程已成功得到許多 P450 BM3 的突變體，特別是那些對一系列甾體底物有影響的突變體，活性增強的突變讓這種自給自足的系統(tǒng)的催化潛力得到更充分利用。P450 BM3 的蛋白質(zhì)工程在甾體羥基化的改良領域中所作的嘗試以及獲得的成果為BM3 羥基化疏水性甾體的深入研究提供了理論依據(jù)。

2.1 催化甾體羥基化的 P450 氧化酶 BM3 的定向進化

目前在大量蛋白質(zhì)結構和功能信息嚴重缺乏的情況下，酶分子的體外定向進化技術不需要事先了解蛋白質(zhì)空間結構和功能之間的關系，適合一切蛋白質(zhì)的改造，極大拓寬了蛋白質(zhì)工程的研究和應用范圍。過去 20年中，定向進化實驗表明單個氨基酸的替換通?？梢蕴岣呙傅拇呋钚曰蚍€(wěn)定性，并且可通過有益突變的積累使酶分子獲得顯著的活性變化（改變 1%～2% 的序列）［8］。

BM3 定向進化的基本原理即在選定的 BM3 或其突變體的基礎上，根據(jù)需要進行基因的突變或重組，使基因發(fā)生變異，再通過一定篩選方法獲得預先期望的具有某些特性（如甾體特定位置的羥基化產(chǎn)物）的進化酶。

在 BM3 定向進化的策略中，兩個最關鍵的環(huán)節(jié)是產(chǎn)生分子多樣性和定向篩選，即突變體文庫的構建和目標表型篩選。

2.1.1 突變體文庫的構建 為了得到多樣性分子結構，建立突變體文庫最廣泛采用的方法是隨機突變的易錯 PCR［18］。例如，以 BM3 的三突變體 R47L/F87V/L188Q 為模板，經(jīng)過第一輪易錯 PCR 篩選得到突變體 M01、M02，以 M01為模板經(jīng)過兩輪易錯 PCR 篩選得到的 M11［19］能羥基化睪酮、黃體酮、去甲雄烯二酮等甾體［20-21］，并且形成不同構型和不同位置的羥基化產(chǎn)物?；?1393（BM3 的突變體）隨機突變得到的突變體 5B10 能使黃體酮 16，17 位環(huán)氧化。16，17-環(huán)氧化是甾體激素合成的重要中間體［22］。環(huán)氧化疏水性甾體在制藥行業(yè)甾體的合成中發(fā)揮重要作用。

2.1.2 突變體文庫的篩選 在突變體文庫產(chǎn)生之后，篩選的條件決定著蛋白質(zhì)預期特征的進化方向。實際上，一旦多樣性文庫構建好后，定向進化實驗成敗的關鍵則在于是否有一個針對目標蛋白特定功能的高效篩選方法。

文獻報道了一些關于 CYP450 的活性篩選方法。這些方法包括耗時的和昂貴的色譜光譜和放射化學技術［23-25］，但這些方法只適用純酶的篩選［26］，因此不適合進行高通量篩選。而在一些報道的高通量篩選方法中［27-28］，篩選系統(tǒng)依賴酶對特定底物的轉(zhuǎn)化率，因此應用范圍窄。

在定向進化中最常用的篩選儀器是高通量微孔板酶標儀。根據(jù)底物或產(chǎn)物的反應特征，高通量 96 微孔板可快速、自動、定量地鑒定酶的底物特異性、熱穩(wěn)定性等性狀［29］。Tsotsou 等［30］報道一種新的用微孔板篩選 P450 BM3 突變體的方法，稱為堿法篩選。此法可用于所有同 NADPH 相偶聯(lián)的酶，也可對全細胞（即未破碎的細胞）催化進行檢測，并且對各種類型的 P450 以及各種潛在的底物均可進行篩選。

但對于那些難以或無法建立篩選模型的蛋白質(zhì)來說，定向進化的策略難以奏效。許多 P450 酶參與沒有或很少有官能基團烴的氧化，如鏈烷烴、萜類、甾體或脂肪酸。因此，敏感而高效的篩選方法成為體外定向進化蛋白質(zhì)的瓶頸，有必要繼續(xù)開發(fā)新的高通量、自動化、定量表征酶活力的篩選方法。

2.2 催化甾體羥基化的 P450 氧化酶 BM3 的（飽和）定點突變

2.2.1 定點突變 定點突變是酶基因修飾的重要方法，也是研究蛋白質(zhì)結構與功能的一項非常有價值的工具。定點突變首先需要合成特定的引物，該引物一端含有需要引入的突變，另一端含有同目的 DNA 互補的同源序列，而后用 PCR的方法在 DNA 聚合酶的作用下通過引物同模板發(fā)生同源重組而引入需要的突變，最后篩選得到目的突變體。由于定點突變是在清楚了解酶結構、功能、催化機制的基礎上進行的，能在預先設計的位置建立起突變基因文庫，縮小了有效突變基因文庫的大小，減少工作量，但通常需預先通過理性設計預測或用易錯 PCR 技術篩選到潛在的重要氨基酸殘基位點。

定點突變包括單點突變和組合突變。將 P450 BM3 的2 個突變體（M01 和 M11）的 82 位丙氨酸突變?yōu)樯彼岷螅琈01A82W（M11A82W）均提高了對睪酮和炔諾酮 16β羥基化的選擇性［20］。而將 M01A82W 突變體的 72 位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岷螅a(chǎn)物的立體選擇性改變，可以制備高產(chǎn)率 16α-羥基睪酮（產(chǎn)率達到 81%）［31］。此外，Kille 等［32］通過組合文庫 A、B 和 C 中活性位點的突變獲得甾醇的具有位置選擇性和立體選擇性的羥基化產(chǎn)物。

2.2.2 飽和定點突變 飽和定點突變是一種快速特異的蛋白質(zhì)工程改造方法，通過把蛋白質(zhì)的每一個氨基酸都替換為其他 19 種天然氨基酸來實現(xiàn)。飽和突變通常是在“熱點”氨基酸上進行操作。在許多突變體中，單個氨基酸殘基位點的改變即可提高酶的熱穩(wěn)定性或催化效率。將 CYP102A1突變體 M11 的 87 位苯丙氨酸突變?yōu)槠渌?19 種氨基酸時，發(fā)現(xiàn)不同的突變體能在不同的部位羥基化睪酮，且不同產(chǎn)物的得率和活性有較大差異［33］。

2.3 催化甾體羥基化的 P450 氧化酶 BM3 的蛋白質(zhì)工程的應用

Venkataraman 等［21］通過使用紅球菌突變株 RG9 表達P450 BM3 突變體 M02［19］來評估全細胞生物轉(zhuǎn)化去甲雄烯二酮（NAND）。經(jīng) NMR 證實，純化的 P450 BM3 突變體M02 不但以 95% 的區(qū)域選擇性催化 NAND 形成 16β羥基化去甲雄烯二酮，而且可以得到 16β 產(chǎn)物。全細胞轉(zhuǎn)化 1 g/L 的 NAND 可以生產(chǎn)出 0.35 g/L 16β 羥基化去甲雄烯二酮。全細胞紅球菌突變株 RG9 本身不轉(zhuǎn)化 NAND，表明代謝產(chǎn)物是由 P450 BM3 突變體 M02 催化。研究表明紅球菌是一種新穎和高效的異源表達具有高度選擇性和羥基化甾體活性的 BM3 M02 酶的宿主。

3 結語

目前蛋白質(zhì)工程應用的領域逐漸擴大，涉及基因治療、醫(yī)學診斷、食品和化學工業(yè)等各方面，正在產(chǎn)生巨大的商業(yè)利益。而且，各種新型突變技術和新型檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，推動著蛋白質(zhì)工程研究向縱深發(fā)展。

本文探討了催化甾體羥基化的 P450 氧化酶 BM3 蛋白質(zhì)工程的研究進展。通過新一代測序技術和生物信息學分析等方法，篩選出參與甾體羥基化的相關 CYP450，并對候選基因進行功能驗證，進一步闡明甾體羥基化的可行性和重要性，使羥基化甾體的制備變得越來越容易，特別是滿足制藥行業(yè)對光學活性化合物日益增長的需求。利用蛋白質(zhì)工程獲得的 BM3 突變體通過使用單一的酶使甾體羥化有了區(qū)域選擇性和立體選擇性，從而提供甾體羥基化這一珍貴轉(zhuǎn)化的方便平臺。

但是，由于甾體底物生物溶解性差，底物產(chǎn)物的反饋抑制和全細胞生物催化副產(chǎn)物多等原因，甾體的羥基化效率仍然偏低，并且許多工作仍需要完善以提高潛在的生物催化劑的催化性能。P450 氧化酶 BM3 的一些活性位點的作用機制尚未完全闡明，突變體以何種方式影響底物結合，酶的活性和選擇性并不總是顯而易見。此外，BM3 的催化性能高度依賴含有兩個黃素輔因子的融合還原酶介導的 NADPH到甾體底物的電子轉(zhuǎn)移效率［34］。用來催化電子傳遞的NADPH 輔因子也顯著影響擴大生物催化過程的成本，所以用于藥物代謝物的 CYP450 氧化酶 BM3 還沒有達到工業(yè)生產(chǎn)的要求。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2015.06.014

天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室自主課題重點項目（GTZA201404）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室/衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室

孔建強，Email：jiangqiangk@imm.ac.cn

2015-07-01