融水小型豬剖檢程序以及主要臟器自發(fā)性病變組織學(xué)觀察

施赫赫，孫 俠，劉 科，任海濤，陳 淦，黃 威，鐘志勇，劉運忠，林秋雄，唐小江

(1．廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣東佛山 528248;2．廣東貝格生物科技有限公司，廣東佛山 510642;3．廣州醫(yī)藥工業(yè)研究總院，廣州 510240;4．廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州 510060)

豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)制等方面與人極其相似，小型豬作為實驗動物應(yīng)用十分廣泛，包括腫瘤、心血管病、糖尿病、外科、牙科、皮膚燒傷、血液病、遺傳病、營養(yǎng)代謝病和新藥評價等多個方面［1］。小型豬因體型小，便于實驗研究，許多個國家的研究機(jī)構(gòu)對小型豬已經(jīng)進(jìn)行深入研究和應(yīng)用。臟器解剖學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)是衡量動物遺傳品質(zhì)的重要生物學(xué)特性，在遺傳品質(zhì)鑒定、衡量和動物功能狀態(tài)以及藥物、生物制品非臨床安全性評價中起到重要的作用［2］，這些指標(biāo)的測定及評價對小型豬的研究應(yīng)用具有重要意義和價值。融水小型豬(rongshui miniature pig，RMP)是一種體型小、性情溫馴的小黑豬。2009年本課題組在廣西壯族自治區(qū)融水縣桿洞村苗寨發(fā)現(xiàn)并將該品種引種到廣東佛山三水樂平鎮(zhèn)的小型豬基地進(jìn)行實驗動物化研究。該豬種缺少科學(xué)、系統(tǒng)的觀測數(shù)據(jù)，測定和分析各種生物學(xué)數(shù)據(jù)是融水小型豬實驗動物化的基礎(chǔ)。為此，我們初步對F1代融水小型豬進(jìn)行了主要器官解剖學(xué)和組織學(xué)觀察，制作組織切片進(jìn)行觀察拍照，同時測定了全身血量及血漿量、記錄脊椎數(shù)量和恒齒齒式。

1 材料和方法

1.1 動物來源

6月齡普通級融水小型豬4頭，雌雄各半，由廣東貝格生物科技有限公司(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心小型豬研發(fā)基地)提供。實驗動物及實驗操作經(jīng)過廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 動物飼養(yǎng)條件

飼養(yǎng)環(huán)境為普通級，濕簾通風(fēng)系統(tǒng)和局部保溫?zé)艨刂粕醿?nèi)溫濕度，夏天溫度可控制在28℃ ～30℃，冬天溫度可控制在16℃ ～20℃;每天定時定量飼喂全價顆粒料，上下午各一次;自由飲水。

1.3 主要儀器及試劑

1.3.1 主要儀器:輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國LEICA公司RM2135)，生物組織全自動脫水機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司TS-12C)，生物組織包埋機(jī)及冷凍機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 BM-VII)，攤片烤片機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 CS-VI)，生物組織全自動染色機(jī)(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 RS-18)，病理圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯BX41)。

1.3.2 主要試劑:福爾馬林、石蠟、二甲苯、酒精、伊紅、蘇木素、中性樹膠。

1.4 方法

1.4.1 解剖、組織學(xué)檢查項目

心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、腦、脊髓、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、子宮、卵巢、胸腺、胰腺、淋巴結(jié)、肌肉、坐骨神經(jīng)、甲狀腺、膀胱、膽囊。

1.4.2 解剖

解剖前禁食12 h，麻醉后頸動脈放血，處死后立即分離主要臟器，剔除臟器表面的脂肪和筋膜，用濾紙吸凈表面的血液，使用電子天平稱量實質(zhì)器官重量，并用NICON D4000單反相機(jī)拍照。軟尺測量大小腸長度并記錄頸椎、胸椎、腰椎、骶椎、尾椎、乳頭數(shù)量及齒式。

1.4.3 制片

組織標(biāo)本經(jīng)取材、固定、修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，石蠟切片，HE染色、封片;

1.4.4 讀片

將制作好的HE染色切片置于顯微鏡下，從低倍到高倍觀察組織有無病理變化，并用奧林巴斯BX41顯微鏡拍照。

2 結(jié)果(彩圖見彩插1－7)

2.1 大體解剖流程及解剖圖

對4頭融水小型豬進(jìn)行大體解剖，過程如下:沿氣管旁剪開皮膚，鈍性分離皮下結(jié)締組織和肌肉，找到頸動脈鈍性分離，使用血管夾夾住近心端，在遠(yuǎn)心端作一斜面切口插入導(dǎo)管并用棉線扎緊，放開血管夾放血用于測定全身血量和血漿量。切開腹部中部縱向皮膚，在腹白線處分離皮下結(jié)締組織，肌肉與腹膜;暴露腹腔取出各個器官并稱重拍照;分離胸骨暴露胸腔，取出器官稱重拍照。切開頭顱皮膚，分離皮下結(jié)締組織與肌肉;鋸開顱骨暴露腦組織并取出稱重拍照。取完各臟器后，分別分離出后腿側(cè)的坐骨神經(jīng);分離出脊椎，記錄各段數(shù)量;觀察恒齒，并記錄數(shù)量。大體解剖見圖1。

2.2 臟器重量、臟器系數(shù)、脊椎數(shù)量及恒齒齒式

對4頭融水小型豬測定了臟器重量及臟器系數(shù)，記錄了脊椎數(shù)量等數(shù)據(jù)。臟器重量及臟器系數(shù)見表1，數(shù)據(jù)以平均數(shù)(ˉx)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，未進(jìn)行統(tǒng)計分析。從表1可知，雄性體重小于雌性，除了腎上腺平均重量相同外，其各主要臟器平均重量都是雄性小于雌性。臟器系數(shù)除了胸腺的臟器系數(shù)是雄性大于雌性外，其他主要臟器系數(shù)均是雄性小于雌性。脊椎個數(shù)等其他基礎(chǔ)數(shù)據(jù)(表2)。

表1 融水小型豬體重、臟器重量和臟器系數(shù)的測定結(jié)果Tab．1 The body weight，organ weight and organ coefficient in Rongshui miniature pigs

表2 融水小型豬脊椎個數(shù)、腸長度等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)Tab．2 The basic data such as number of vertebration and length of intestine in Rongshui miniature pigs

2.3 主要臟器觀察與組織學(xué)檢查

對融水小型豬臟器組織進(jìn)行了臟器觀察，拍照，各臟器組織外觀未見明顯病理異常，臟器組織(圖2)。并對各組織器官進(jìn)行了病理切片，各組織檢查結(jié)果如下:

心臟:心肌纖維束排列整齊，未見萎縮、肥大、空泡變性、壞死，未見心肌纖維化，間質(zhì)未見水腫、充血、出血及炎細(xì)胞浸潤(圖3-A)。

肝臟:肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索狀排列，肝細(xì)胞未見變性、壞死，竇內(nèi)皮細(xì)胞及枯否氏細(xì)胞未見增生，未見膽管增生、膽汁瘀滯、纖維化及炎細(xì)胞浸潤(圖3-B)。

脾臟:紅、白髓結(jié)構(gòu)清晰，動脈周圍淋巴鞘清晰可見，中央動脈未見病變，脾小體分布、形態(tài)正常，部分生發(fā)中心清晰，脾竇未見出血(圖4-A)。

肺臟:細(xì)、小支氣管周淋巴細(xì)胞浸潤;肺泡管及肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡未見擴(kuò)張、萎陷，肺泡壁毛細(xì)血管未見擴(kuò)張、充血，肺泡間隔未見增厚，肺泡腔清晰，未見肺水腫和肺出血，肺泡內(nèi)未見巨噬細(xì)胞聚集(圖4-B)。

腎臟:皮、髓結(jié)構(gòu)清晰，腎小球未見明顯增大、萎縮、空泡化、玻璃樣變、硬化，腎小管未見萎縮、肥大、增生、再生、空泡化、嗜堿性變、色素沉著、凝固性壞死，腎小管管腔未見擴(kuò)張，未見透明管型、礦物質(zhì)沉積，間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生，腎乳頭未見壞死，腎盂未見擴(kuò)張積水及炎細(xì)胞浸潤(圖5-A)。

腎上腺:皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶細(xì)胞排列及形態(tài)正常，髓質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及分布正常，各區(qū)細(xì)胞未見增生、萎縮，未見出血、壞死及炎癥反應(yīng)(圖5-B)。

大腦:大腦皮質(zhì)各層神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，未見萎縮、變性、壞死、增生等改變，間質(zhì)未見水腫、充血、出血，未見炎癥細(xì)胞浸潤及血管浸潤套形成。白質(zhì)未見脫髓鞘，室管膜及脈絡(luò)膜未見異常，未見腦室積水(圖6-A)。

小腦:皮質(zhì)中浦肯野細(xì)胞及各種神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，各層組織結(jié)構(gòu)清晰，腦膜未見充血，蛛網(wǎng)膜下腔未見水腫及滲出物，小腦組織神經(jīng)元未見腫脹，胞漿未見空泡形成，未見核偏位;未見神經(jīng)細(xì)胞壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生，未見軟化灶形成;腦組織間質(zhì)未見水腫、血管擴(kuò)張充血、瘀血及炎癥細(xì)胞浸潤，白質(zhì)未見脫髓鞘(圖6-B)。

腦干:腦干各神經(jīng)核團(tuán)形態(tài)清晰、正常，神經(jīng)元細(xì)胞較大、神經(jīng)突起明顯，神經(jīng)核大、核仁清晰。神經(jīng)纖維束分布正常。腦干內(nèi)未見出血、壞死灶(圖6-C)。

脊髓:白質(zhì)和灰質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，灰質(zhì)呈H型，脊髓灰質(zhì)前角運動神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)排列正常，未見變性、壞死表現(xiàn)，脊髓側(cè)角和后角神經(jīng)元及中央管結(jié)構(gòu)亦正常，未見神經(jīng)細(xì)胞壞死及嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象;未見血管擴(kuò)張充血、出血;白質(zhì)有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)清晰、未見脫髓鞘(圖7-A)。

胃:粘膜上皮完整，腺體排列整齊，未見糜爛、出血、壞死或潰瘍形成。胃壁細(xì)胞及主細(xì)胞形態(tài)正常，未見萎縮、變性或壞死，未見化生或異型增生。肌層未見肥厚、萎縮或出血、壞死。漿膜未見充血、水腫及炎癥細(xì)胞滲出(圖8A)。

十二指腸:粘膜上皮組織部分自溶，考慮未及時固定(圖8-B)。

空腸:粘膜上皮組織部分自溶，考慮未及時固定(圖9-A。)

回腸:絨毛間質(zhì)充血、少量炎細(xì)胞浸潤(圖9-C)。

結(jié)腸:粘膜層見粘膜相關(guān)淋巴組織(圖9-B)。

睪丸:生精小管結(jié)構(gòu)清晰，各級生精細(xì)胞形態(tài)正常，精子細(xì)胞清晰可見，支持細(xì)胞未見異常，未見曲細(xì)精管萎縮、多核巨細(xì)胞生成改變;間質(zhì)細(xì)胞未見增生;間質(zhì)未見水腫、充血、出血及炎癥細(xì)胞浸潤(圖10-A)。

附睪:附睪管上皮細(xì)胞未見空泡化，管腔內(nèi)可見大量精子，未見精子肉芽腫，間質(zhì)未見水腫、充血、出血及炎細(xì)胞浸潤(圖10-B)。

前列腺:腺體松散分布，腺腔內(nèi)可見分泌物，間質(zhì)疏松、量少，未見腺上皮增生、間質(zhì)纖維組織增生、間質(zhì)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤等病理改變(圖10-C)。

子宮:子宮壁各層結(jié)構(gòu)清晰，子宮內(nèi)膜粘膜上皮呈單層柱狀排列，粘膜下固有膜結(jié)締組織內(nèi)有子宮腺，子宮肌層和子宮外膜未見明顯病理異常(圖11-B)。

卵巢:各級卵泡、黃體，數(shù)量正常，未見濾泡囊腫、血腫及腫物形成(圖11-A)。

胸腺:胸腺皮、髓質(zhì)形態(tài)正常，分界清晰，皮質(zhì)未見萎縮，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞形態(tài)及分布正常，髓質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及分布未見異常(圖12-B)。

胰腺:胰腺組織結(jié)構(gòu)未見異常，可見外分泌部和胰島，胰島細(xì)胞排列正常，外分泌部腺泡上皮細(xì)胞未見細(xì)胞萎縮、變性、壞死，未見炎細(xì)胞浸潤(圖14-B)。

淋巴結(jié):皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)形態(tài)正常，帽區(qū)、明區(qū)和暗區(qū)清晰可見，副皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞形態(tài)及分布正常，髓竇及被膜下淋巴竇形態(tài)未見異常(圖13-B)。

甲狀腺:甲狀腺組織結(jié)構(gòu)未見異常，甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)正常，濾泡上皮細(xì)胞未見變性、壞死，濾泡旁細(xì)胞未見增生，未見炎癥細(xì)胞浸潤(圖12-A)。

膀胱:粘膜(變移上皮)由三層至數(shù)層移行上皮細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞未見變性、壞死、脫落，固有膜內(nèi)膠原纖維、彈力纖維未見變性、增生等改變，肌層內(nèi)平滑肌纖維形態(tài)排列正常，各層組織中未見炎細(xì)胞浸潤(圖13-B)。

膽囊:粘膜固有層見炎細(xì)胞浸潤(圖14-A)。

皮膚:表皮結(jié)構(gòu)完整，真皮層的膠原纖維、皮膚附件結(jié)構(gòu)清晰，未見壞死、水腫、充血、出血及炎細(xì)胞浸潤(圖15-A)。

肌肉:肌漿紅染，橫紋清晰，細(xì)胞核位于肌纖維周邊部。未見肌纖維凝固性壞死，間質(zhì)水腫、充血、出血及炎細(xì)胞浸潤(圖15-B)。

坐骨神經(jīng):神經(jīng)纖維平行排列，未見神經(jīng)纖維變性及脫髓鞘(圖7-B)。

3 討論

本研究對融水小型豬的29個器官進(jìn)行外觀和組織切片觀察及拍照，保存了大體解剖和組織學(xué)的資料，充實了融水小型豬的生物學(xué)數(shù)據(jù)。各臟器組織外觀未見明顯病理異常，僅肺顏色有點暗紅;組織學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)，肺臟細(xì)小支氣管周淋巴細(xì)胞浸潤，其他器官均為正常，未發(fā)現(xiàn)病理性變化。

將融水小型豬的組織切片結(jié)果與《西藏小型豬組織胚胎學(xué)研究》［3］和《貴州小型豬組織學(xué)圖譜》［4］進(jìn)行比對，骨骼肌橫斷面組織切片的比較中，融水小型豬的骨骼肌肌束之間結(jié)締組織和肌間脂肪比西藏小型豬與貴州小型豬少，骨骼肌更致密，這與大體解剖觀察到的一致。

豬淋巴結(jié)的組織結(jié)構(gòu)并不完全與人類的相同，皮質(zhì)和髓質(zhì)可以分別出現(xiàn)于外周區(qū)域和中央?yún)^(qū)域，西藏小型豬淋巴結(jié)皮質(zhì)和髓質(zhì)交替存在［3］。但貴州小型豬的髓質(zhì)成分分布在外周，皮質(zhì)則位于淋巴結(jié)的中央部分［4］。從融水小型豬淋巴結(jié)組織切片來看，其皮質(zhì)區(qū)同樣可以出現(xiàn)在外周區(qū)域，而髓質(zhì)分布于中央?yún)^(qū)域，說明融水小型豬與西藏小型豬在淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)上與人更加接近。

實驗動物的自發(fā)性病變存在于普通級、SPF級動物，如大鼠、比格犬、食蟹猴、樹鼩等都有相關(guān)報導(dǎo)［5－10］。引起自發(fā)性病變的因素很多，如遺傳、營養(yǎng)、用藥、中毒及環(huán)境因素等，也包括原因未明的傳染因子［8］。有的還與年齡增長相關(guān)［11－12］。徐永華等［13］的研究認(rèn)為，人類和其他動物在支氣管、小支氣管周圍有不同程度炎細(xì)胞浸潤，而且肺內(nèi)塵細(xì)胞較多，是與生存環(huán)境空氣受污染有關(guān)。西藏小型豬由于長期生存在很少受污染的高原寒冷環(huán)境，呼吸系統(tǒng)是清潔的。同樣地，由于融水小型豬在普通級環(huán)境下飼養(yǎng)，而呼吸系統(tǒng)各器官屬于管腔器官，容易與空氣中物理性、化學(xué)性物質(zhì)如粉塵、氨氣等接觸，刺激引起小支氣管、細(xì)支氣管的病理變化。另外，小支氣管、細(xì)支氣管黏膜細(xì)胞浸潤，存在病原體影響的可能性。在融水小型豬的肺臟組織切片中，只發(fā)現(xiàn)小支氣管、細(xì)支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，肺內(nèi)未發(fā)現(xiàn)塵細(xì)胞，其他結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)病理性變化，這也說明了飼養(yǎng)環(huán)境中的刺激因素比較小，或者病原體對肺臟的影響較小。

本研究使用的融水小型豬總體健康狀況良好，其組織器官外觀正常，組織切片檢查基本正常，可以作為融水小型豬病理性檢查的正常組織切片參考依據(jù)。同時，從本次研究的結(jié)果也可以從側(cè)面反映出，在融水小型豬飼養(yǎng)管理過程中，較好的控制了環(huán)境、飼料和微生物等環(huán)節(jié)。融水小型豬在醫(yī)學(xué)實驗相關(guān)方面是一種具有潛力的實驗動物。由于實驗動物的自發(fā)性病變會影響動物質(zhì)量和干擾動物實驗結(jié)果，提示在融水小型豬的整個飼養(yǎng)管理過程中，必須嚴(yán)格執(zhí)行各方面質(zhì)量控制體系，盡量減少外部誘因?qū)θ谒⌒拓i自發(fā)性病變的影響。

［1］ 張德福，劉東．國內(nèi)外小型豬實驗動物化研究［J］．生物學(xué)通報，2004，39(10):14 －16．

［2］ 閔凡貴，潘金春，王希龍，等．影響五指山小型豬主要臟器重量及臟器系數(shù)的因素分析［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(10):218－222．

［3］ 那順巴雅爾．西藏小型豬組織胚胎學(xué)研究［D］．廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2009．

［4］ 甘世祥，錢寧，馮濟(jì)鳳，等．貴州小型豬組織學(xué)圖譜［M］．貴州:貴州科技出版社，2001．

［5］ 喬俊文，陸妲磊，孫景軍，等．藥物臨床前安全性評價中食蟹猴常見自發(fā)性病變［J］．中國藥理與毒理學(xué)雜志，2013，27(3):548．

［6］ 徐文漭，李霞，李濤，等．恒河猴、比格犬、樹鼩、兔、大鼠及小鼠消化管的比較組織學(xué)［J］．臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29(11):1211－1217．

［7］ 蘇曉鷗，戴益民，弓雪蓮，等．毒性試驗中SD大鼠常見自發(fā)性病變［J］．中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27(3):518．

［8］ 王輝，陸妲磊，盛嬅，等．SPF級F344大鼠的臟器重量和自發(fā)性病變的研究［J］．毒理學(xué)雜志，2007，21(4):291 －292．

［9］ 羅灼玲，張立群，李文，等．實驗動物比格(Beagle)犬自發(fā)性病變的研究［J］．廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1999，16(2):151－154．

［10］ 程樹軍，黃韌，秦瑤．比格犬肝臟自發(fā)性病變的組織學(xué)研究［J］．上海實驗動物科學(xué)，2003，23(4):200 －202．

［11］ 徐艷峰，馬春梅，黃瀾，等．Wistar大鼠心臟自發(fā)性病變的病理學(xué)觀察［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(2):6 －8．

［12］ 胡建延，英永，邱波，等．不同周齡SPF級SD大鼠胰腺自發(fā)性病變的組織學(xué)觀察［J］．2012，33(8):65－68．

［13］ 徐永華，張東輝，許琴，等．西藏小型豬心臟、呼吸系統(tǒng)組織學(xué)觀察［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(8):61 －62．