丁進(jìn)海

摘要 根據(jù)粗蛋白測定過程中的各個(gè)步驟研究了飼料中粗蛋白測定中消化爐的溫度、消化爐消化的時(shí)間、催化劑用量、硼酸吸收液加堿量、蒸餾時(shí)間以及鹽酸濃度等影響因素，并確定一些常規(guī)飼料中蛋白質(zhì)測定的條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，消化溫度為420 ℃時(shí)效果最佳，消化時(shí)間最好控制在2 h以上，催化劑用量以6.4 g最為準(zhǔn)確，硼酸吸收液是否加堿對(duì)測定結(jié)果影響較小，蒸餾時(shí)間在5 min之后蒸餾完全，鹽酸的濃度選擇則需要根據(jù)試樣的大體粗蛋白含量進(jìn)行選擇，因此影響消化效果的因素主要有消化溫度、消化時(shí)間、催化劑用量。

關(guān)鍵詞 飼料；粗蛋白測定；影響因素；消化溫度；消化時(shí)間；催化劑

中圖分類號(hào) S816.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2015）17-0302-03

粗蛋白是食品以及飼料中含氮化合物的總稱，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是構(gòu)成生命體細(xì)胞、抗體、免疫激素、酶等的主要成分，也是人類以及動(dòng)物個(gè)體補(bǔ)充能量的原料。特別是飼料中蛋白質(zhì)含量的高低或者蛋白質(zhì)的品質(zhì)都很重要，關(guān)乎一些動(dòng)物個(gè)體的生長速度、新陳代謝、繁殖發(fā)育，因此測定飼料中的蛋白質(zhì)對(duì)于人類生活顯得尤為重要。如今，隨著人民生活水平的提高，對(duì)肉蛋禽類食品的需求量日益增加，而與其對(duì)應(yīng)的飼料工業(yè)也快速發(fā)展和進(jìn)步。雖然粗蛋白測定仍然無法鑒別三聚氰胺、尿素以及添加劑中某些含氮物質(zhì)，但是粗蛋白質(zhì)的含量也大體代表了飼料中蛋白含量，因此飼料中粗蛋白質(zhì)含量的測定也越來越重要[1-3]。

粗蛋白檢測方法有國標(biāo)法、強(qiáng)堿直接蒸餾法、雙氧水測定法、雙縮脲法、凱氏定氮法，最常用的檢測方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法是影響因素易控制的方法，原理是試樣與濃硫酸和催化劑一同消化，使蛋白質(zhì)遭到破壞，使試樣中的蛋白質(zhì)氮及其他有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，然后與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，加入堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再以酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，測出含氮量[4-6]。

凱氏定氮法影響因素：消化溫度對(duì)測定飼料中粗蛋白的影響，溫度過高或者過低都會(huì)造成數(shù)據(jù)偏高，溫度過低是因?yàn)橄煌耆?，溫度過高會(huì)造成氮的散失；消化時(shí)間對(duì)測定蛋白的影響和消化溫度差不多；催化劑影響了消化的速度；硼酸吸收液也會(huì)影響測定的精度；蒸餾時(shí)間對(duì)結(jié)果也會(huì)有影響；選用合適的鹽酸濃度，對(duì)測定飼料中粗蛋白的含量精度也很重要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)飼料選用大豆粕、進(jìn)口魚粉、玉米秸稈，其他試驗(yàn)儀器與試劑詳見《GB/T6432—1994飼料中粗蛋白測定方法》[7]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凱氏定氮法測定飼料中的粗蛋白。蛋白質(zhì)是一種含氮有機(jī)化合物，飼料中的蛋白質(zhì)包括真蛋白和非蛋白氮，統(tǒng)稱為為粗蛋白，凱氏定氮法適合一些配合飼料、濃縮飼料和一些單一飼料粗蛋白的測定[7]，將試樣中的含氮物質(zhì)經(jīng)過催化劑和濃硫酸的共同消化，把試樣中的含氮有機(jī)物轉(zhuǎn)化成硫酸銨的形式，再經(jīng)過凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾，加堿，使硫酸銨中的氨反應(yīng)生成氨氣。再用硼酸吸收液將氨氣或者氨水吸收，再用鹽酸進(jìn)行滴定，根據(jù)換算系數(shù)、計(jì)算公式，計(jì)算出試樣中含有的粗蛋白含量。

1.2.2 消化爐設(shè)定溫度的影響試驗(yàn)?？刂撇煌O(shè)定溫度，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)樣品采用大豆粕。溫度設(shè)置380、400、420、440、460 ℃ 5個(gè)梯度，設(shè)定空白試驗(yàn)（即不加大豆粕，其他試驗(yàn)條件相同）作為對(duì)照，根據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.2.3 消化爐消化時(shí)間的影響試驗(yàn)?？刂撇煌瘯r(shí)間進(jìn)行單因素變量試驗(yàn)，設(shè)定消化時(shí)間分別為30、60、120、180、240、300 min 6個(gè)不同的溫度，試驗(yàn)樣品采用大豆粕，每個(gè)溫度稱取2組，再做2個(gè)空白組對(duì)照試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件保持不變，均采用GB/T6432—94中規(guī)定的試驗(yàn)條件，根據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.2.4 催化劑用量的影響試驗(yàn)。采用硫酸銅∶硫酸鉀=1∶15的混合催化劑進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)樣品采用大豆粕，分別設(shè)置3.4、4.4、5.4、6.4、7.4 g 5個(gè)不同量的催化劑用量，不同溫度稱取2組，再做2個(gè)空白組對(duì)照試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件保持不變，均采用GB/T6432—94中規(guī)定的試驗(yàn)條件，根據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.2.5 硼酸吸收液加堿的影響試驗(yàn)。配置不同的催化劑進(jìn)行單一因素變量試驗(yàn)，根據(jù)GB/T6432—94中硼酸的配置方法進(jìn)行配置，設(shè)2個(gè)處理，即1 000 mL硼酸吸收液中加入0.5 mL 4%氫氧化鈉（A），硼酸吸收液中不加氫氧化鈉（B），其他試驗(yàn)因素按照GB/T6432—94中規(guī)定的試驗(yàn)條件進(jìn)行蒸餾滴定。并分別做了空白和回收率試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做了3個(gè)平行試驗(yàn)。在試驗(yàn)中吸收液的酸堿度是否合適，可以通過以下方式進(jìn)行簡單的判斷：移取10 mL硼酸吸收液，先加入100 mL蒸餾水，再加入幾滴蛋白指示劑，如果指示劑變色，則說明酸度合適；如果仍然為紅色，那么需要往硼酸吸收液中加適量的堿。硼酸的濃度對(duì)結(jié)果影響不大，均能夠完全吸收氨氣，因?yàn)榕鹚崾亲銐蜻^量的。由于硼酸是一種酸性極弱的酸，所以pH值比較容易調(diào)節(jié)，而且容易與蒸餾出來的氨結(jié)合形成硼酸銨，利于用鹽酸進(jìn)行滴定，無其他化學(xué)反應(yīng)的干擾。

1.2.6 蒸餾時(shí)間的影響試驗(yàn)。蒸餾時(shí)間設(shè)3、4、5、6、7 min 5個(gè)梯度，其他因素保持不變，試驗(yàn)具體操作根據(jù)GB/T6432—94中試驗(yàn)步驟進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定溶液測定，根據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.2.7 鹽酸濃度的影響試驗(yàn)。選用0.10、0.05、0.01 mol/L 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定溶液和3種蛋白質(zhì)含量不同的樣品（魚粉、大豆粕、玉米秸稈飼料）進(jìn)行分組交叉試驗(yàn)，同時(shí)分別做空白對(duì)照試驗(yàn)，共12組平行試驗(yàn)。其他試驗(yàn)條件保持不變，均采用GB/T6432—94中規(guī)定的試驗(yàn)條件，根據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算endprint

設(shè)定3個(gè)平行試驗(yàn)，運(yùn)用Excel對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理制表和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化溫度的影響

控制消化爐溫度試驗(yàn)結(jié)果見圖1。380、400 ℃的消化管中顏色為不透明的黑色，證明沒有消化完全，而其他溫度下的消化管均為藍(lán)色透明。分析數(shù)據(jù)表明，消化溫度以420 ℃效果最佳。

2.2 消化時(shí)間的影響

控制消化時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果見圖2。30 min消化出的樣品為黑色，60 min為淡藍(lán)色，其他時(shí)間消化出的樣品均為藍(lán)透明色。分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：在樣品變綠后消化30 min蛋白質(zhì)的含量偏低，隨著消化時(shí)間的不斷增大，蛋白含量逐漸增加，從2 h開始，蛋白質(zhì)含量增加緩慢，消化2 h的蛋白質(zhì)含量和消化5 h的蛋白含量沒有顯著差異，由此可見樣品消化時(shí)間最好控制在樣品變綠后2 h以上。

2.3 催化劑用量的影響

控制催化劑用量的單因素變量試驗(yàn)結(jié)果見圖3。催化劑用量為3.4、4.4 g的試驗(yàn)組消化完的樣品顏色均為黑色，催化劑用量為6.4 g的試驗(yàn)組為藍(lán)色透明色，催化劑用量為7.4 g的試驗(yàn)組樣品消化管內(nèi)壁有黑色渣子。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在催化劑用量6.4 g的情況下消化最為完全準(zhǔn)確，催化劑用量過多會(huì)造成消化管內(nèi)壁有黑色殘?jiān)?，催化劑用量太少?dǎo)致消化不完全，均對(duì)結(jié)果有不利影響。

2.4 硼酸吸收液是否加堿的影響

通過控制硼酸吸收液是否加堿用量，探究硼酸吸收液是否加堿對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，分析數(shù)據(jù)見表1?？梢钥闯?，試驗(yàn)中硼酸吸收液中加入適量的堿，會(huì)導(dǎo)致空白值增大。但是對(duì)測定結(jié)果影響并不大，因?yàn)榕鹚嵛找核釅A度對(duì)飼料樣品和空白對(duì)照組的作用是一致的，這樣就可以將影響抵消。

2.5 蒸餾時(shí)間的影響

對(duì)蒸餾時(shí)間進(jìn)行控制的單因素變量試驗(yàn)結(jié)果見圖4。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，蒸餾時(shí)間在5 min之后，消化管中的游離氨全部被蒸餾出來，被硼酸吸收。3～4 min時(shí)未蒸餾完全；5～7 min都在允差范圍內(nèi)，表明蒸餾完全；但是在7 min時(shí)，蒸餾液已經(jīng)超過了錐形瓶的2/3，不利于進(jìn)行滴定試驗(yàn)。

2.6 鹽酸濃度的影響

對(duì)魚粉、豆粕、秸稈飼料3個(gè)樣品分別用3種不同濃度鹽酸進(jìn)行滴定的結(jié)果見圖5～7。通過分析，魚粉組在3種鹽酸濃度中濃度大小與誤差的大小成正相關(guān)關(guān)系，即鹽酸的濃度越小，對(duì)測定的結(jié)果差異越大。而玉米秸稈飼料組的數(shù)據(jù)也與鹽酸的濃度成一定的規(guī)律（僅限這3種濃度下），即鹽酸濃度越大，其平行數(shù)據(jù)間的誤差越大，標(biāo)準(zhǔn)差較大。經(jīng)過試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，每種樣品鹽酸滴定的平均消耗用量見表2。通過以上數(shù)據(jù)表格分析，鹽酸在滴定量小于5 mL或者大于40 mL時(shí)，滴定誤差比較大，蛋白含量較高時(shí)適合用高濃度酸滴定，蛋白含量較低時(shí)適合用低濃度的鹽酸滴定溶液更準(zhǔn)確。

3 結(jié)論與討論

消化溫度會(huì)影響消化的完全程度，從而影響測定粗蛋白的試驗(yàn)結(jié)果，溫度小于420 ℃會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏小，溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，氨類物質(zhì)散失，也會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏小，造成試驗(yàn)誤差。消化時(shí)間的長短就比較容易控制，只要消化時(shí)間達(dá)到2 h，消化就可以反應(yīng)完全，而超過2 h，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，粗蛋白的含量沒有顯著增加或減少，因此建議達(dá)到2 h。催化劑用量在6.4 g最為準(zhǔn)確，過少導(dǎo)致消化不完全，過多會(huì)導(dǎo)致消化管產(chǎn)生黑殘?jiān)?；而硼酸?duì)于粗蛋白測定結(jié)果的影響較小，在調(diào)節(jié)pH值加入堿后，試驗(yàn)滴定空白更加明顯，有利于顏色判斷；蒸餾時(shí)間在5 min之后蒸餾完全；鹽酸的濃度選擇則需要根據(jù)試樣的大體粗蛋白含量進(jìn)行選擇，通過對(duì)影響粗蛋白測定的每個(gè)因素進(jìn)行單因素變量試驗(yàn)的分析，對(duì)粗蛋白測定結(jié)果影響最大的是消化階段，而影響消化效果的因素主要為消化溫度、消化時(shí)間、催化劑用量。

4 參考文獻(xiàn)

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[7] 飼料中粗蛋白測定方法：GB/T 6432-1994 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.endprint