美卡精子密度儀在豬精子密度測定中的應(yīng)用

曾 敏 ，李 姣 ，姚 立 ，石 挺 ，呂 軒 ，雷 勇 ，李文平 ，※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧水產(chǎn)局，湖南長沙410006）

隨著養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，豬人工授精技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越多，它具有提高良種利用率、減少疾病傳播和降低飼料成本等優(yōu)勢，是目前我國推行豬品種改良最有效的方法[1-2]。公豬精子密度的高低直接決定母豬生產(chǎn)性能和產(chǎn)仔數(shù)量，是人工授精的關(guān)鍵[3]。根據(jù)《種豬常溫精液國家標準》，最常使用的是血球計數(shù)板法，其準確率最高，但操作過于繁瑣[4]。目前較方便的是分光光度計法，美卡精子密度儀正是基于這一原理研發(fā)出的用于測定家畜精液精子密度的一種較先進設(shè)備，它的應(yīng)用使得精子密度的測定變得快速而簡便。但目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于其在公豬精液密度中的實用性報道，本文主要針對其重復(fù)性和對不同品種公豬的測定結(jié)果進行分析，旨在為美卡精子密度儀在豬精子測定中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及儀器、試劑

大白、長白、杜洛克種公豬，由瀏陽仁和種公豬站提供。

美卡精子密度儀，意大利美的科卡動物育種公司制造。血細胞計數(shù)板、顯微鏡等常規(guī)試驗器具與試劑由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床實驗室提供。

越豐1號長效稀釋液由濟南洛克工貿(mào)有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 精液的采集與處理

用手套采精法采集公豬精液，采精前注意剃除包皮周圍的被毛，舍棄射精初期的部分和凝膠部分。將精液過濾后用稀釋液作梯度稀釋，分裝在集精瓶中，置于17℃恒溫箱中保存。每個品種分別采10頭公豬精液，在12h內(nèi)進行檢測。

1.2.2 密度的測定

血球計數(shù)板法：先按1:200的比例進行稀釋，取20μL稀釋好的精液轉(zhuǎn)移到計數(shù)板上，5min后在400倍顯微鏡下進行計數(shù)。選取位于計數(shù)板中心的5個大格的精子數(shù)量，通過換算得出每毫升的精子數(shù)量。

精子密度儀測定法：用稀釋液將儀器校零后，吸取0.2mL混勻的新鮮精液注入測試瓶中，然后加入9.8mL稀釋液，通過移液器混勻后蓋上測試瓶蓋子；按READ/DIRECT鍵，等待顯示屏上出現(xiàn)一個透光系數(shù)，對比說明書得出所測樣品的精子密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果

2.1 精子密度儀檢測的可重復(fù)性和一致性

表1 精子密度儀的可重復(fù)性統(tǒng)計分析

從表1可知，同一樣品連續(xù)檢測12次，其精子密度變化很小，數(shù)據(jù)之間的差異不顯著（P>0.05），表明該儀器可重復(fù)性良好。變異系數(shù)也顯示該檢測系統(tǒng)具有較好的一致性。

2.2 精子密度儀檢測與血球計數(shù)法的比較

表2 精子密度儀在杜洛克公豬精液中的使用結(jié)果

表3 精子密度儀在大白公豬精液中的使用結(jié)果

表4 精子密度儀在長白公豬精液中的使用結(jié)果

通過對比分析可知，精子密度儀與計數(shù)板檢測結(jié)果之間有直線回歸關(guān)系，且不同品種公豬精液中的回歸方程有所不同，杜洛克為y=0.6502x+0.0128，大白為y=0.8364x+0.0511，長白為y=0.86x-0.0102?；貧w關(guān)系均達顯著水平（P＜0.05），其中大白與長白的回歸方程很相似。（式中：y為實際密度，x為系統(tǒng)檢測密度)。

從表2、3、4可以看出，精子密度儀換算后結(jié)果與計數(shù)板所測的豬精子密度結(jié)果無顯著差異（P>0.05），相關(guān)性較好，表明精子密度儀測定豬精子密度有較高的準確性，可以代替計數(shù)板法在生產(chǎn)應(yīng)用中的使用。

3 討論

目前常用的檢測精子密度的方法有血球計數(shù)法、分光光度法和流式細胞儀法[5-7]。血球計數(shù)法因為操作繁瑣，重復(fù)性差[8]，在生產(chǎn)應(yīng)用中較少使用；流式細胞儀法雖無此缺點，但其儀器昂貴，在養(yǎng)殖場中也極少見到[9]。利用分光光度法測定精子密度的方法始于上世紀七八十年代，其具有快速、簡便的優(yōu)點，但由于當(dāng)時的技術(shù)條件不成熟，導(dǎo)致其準確性不高。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提高和一次性濾紙應(yīng)用使得分光光度法在豬精子密度檢測中的應(yīng)用成為了可能。美卡精子密度儀是由意大利美的科卡動物育種公司出品，用來測定家畜精液中精子密度的一種較先進設(shè)備，其原理為在特定波長下測定待檢樣品的吸光度，通過吸光度與精子密度的函數(shù)轉(zhuǎn)換，對樣品進行定量分析。

利用美卡精子密度儀檢測豬精子密度的結(jié)果需要轉(zhuǎn)換的原因是其設(shè)定的程序并非是檢測豬精子密度，所以需要進行矯正。通過對精子密度儀的重復(fù)性和一致性研究發(fā)現(xiàn)，該儀器可重復(fù)性良好，具有較好的一致性。應(yīng)用精子密度儀對不同品種公豬精液進行檢測，對比計數(shù)板的結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有顯著的直線回歸關(guān)系。經(jīng)換算，精子密度儀與計數(shù)板法所測結(jié)果無顯著差異，表明其準確性較高。測得的密度值偏大可能是因為測定用的玻璃杯在使用過程中有一些磨損導(dǎo)致透光率下降或者操作時間較長，水分蒸發(fā)所導(dǎo)致。試驗結(jié)果顯示，大白豬和長白豬的回歸方程相似，與杜洛克的回歸方程有較大差異，這可能與品種有關(guān)。有報道[10]指出，杜洛克公豬的精子活率和運動能力顯著高于大白豬和長白豬。另外，不同品種公豬的睪丸大小、精子畸形率也不一樣[11-12]，但究竟是何原因還有待進一步深入探究。試驗數(shù)據(jù)表明，美卡精子密度儀對精子密度很高的精液和精子密度較低的精液準確性不理想，而對精子密度在0.6~2.7億/mL的精液測定結(jié)果最可靠。因此，在檢測精子密度之前，建議將原精進行適當(dāng)4~8倍稀釋。種豬常溫精液標準中對精子密度的要求是大于1億/mL，說明美卡精子密度儀能適用生產(chǎn)實際中的需要。

綜上所述，美卡精子密度儀具有準確、快速、簡便等優(yōu)點，能取代復(fù)雜而繁瑣的血細胞計數(shù)法在生產(chǎn)實際中的使用，這不僅能提高實驗人員的工作效率，還能使精液得到較好的稀釋，從而提高精液產(chǎn)品的質(zhì)量和農(nóng)戶的生產(chǎn)效益。隨著養(yǎng)殖條件的不斷提高，美卡精子密度儀的應(yīng)用將逐步擴大。

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