一起保育豬沙門氏菌感染的診斷與藥敏檢測分析

黃婕峰，李 淼，馬 攀，李潤成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

豬沙門氏菌病，又稱豬副傷寒，是由沙門氏菌屬包括豬霍亂沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌變型、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌變型、德爾俾沙門氏菌等引起的一種傳染病[1]。主要表現(xiàn)為急性敗血癥和壞死性腸炎，慢性病例則多為肺炎及大腸壞死性炎癥。病豬常因生長受阻和增重緩慢而給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。2014年8月衡陽某40頭母豬的小型豬場，50~60日齡保育豬全部腹瀉，部分有嘔吐現(xiàn)象，體溫?zé)o明顯變化，補(bǔ)種了豬瘟、偽狂犬病毒疫苗同時也使用了一些抗生素藥物，均無明顯好轉(zhuǎn)，15天內(nèi)，死亡13頭。本文對2頭發(fā)病典型的小豬進(jìn)行了實驗室診斷，分離到了大量沙門氏菌并進(jìn)行了藥物敏感性檢測?，F(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1病料。衡陽某豬場2頭發(fā)病典型的小豬。

1.2主要試劑及細(xì)菌培養(yǎng)基。巧克力瓊脂培養(yǎng)基購自鄭州貝瑞特公司，PCR試劑購自北京天恩澤基因科技有限公司，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州貝瑞特生物技術(shù)有限公司。

1.3發(fā)病小豬的解剖。將發(fā)病小豬處死并進(jìn)行解剖、觀察各臟器及腸道的情況。

1.4細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定。

1.4.1 按無菌操作要求用接種環(huán)鉤取肝臟、腸系膜淋巴結(jié)分別劃線接種巧克力瓊脂培養(yǎng)基，然后將巧克力瓊脂放于37℃培養(yǎng)，48h后觀察結(jié)果并取培養(yǎng)物涂片革蘭染色鏡檢。

1.4.2 選取接種病豬肝臟的巧克力營養(yǎng)瓊脂，從中隨機(jī)挑取20個單菌落劃線接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果。

1.5分離菌的P CR鑒定

以沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上長出紫色菌落為模板，用細(xì)菌16SRNA通用引物[2]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將陽性PCR產(chǎn)物送上海華大基因公司進(jìn)行測序分析。

1.6分離細(xì)菌的藥物敏感性試驗

從沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上挑取紫色菌落接種血清肉湯培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)24h，然后用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性檢測，具體操作按常規(guī)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1病豬解剖結(jié)果

將發(fā)病小豬處死、解剖、觀察各臟器及腸道的情況，主要病理變化為，小豬回腸、結(jié)腸充滿糠麩樣物質(zhì)（見圖 1）。

圖1 發(fā)病豬腸道糠麩樣物質(zhì)

2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

用病豬肝臟、腸系膜淋巴結(jié)接種巧克力瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后觀察細(xì)菌生長形態(tài)結(jié)果從肝臟、腸系膜淋巴結(jié)均分離出了大量細(xì)菌，且肝臟、淋巴結(jié)分離菌形態(tài)特征一致，挑取菌落涂片革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果見分離菌為革蘭氏陰性桿菌。

2.3培養(yǎng)物的鑒定結(jié)果

2.3.1 選取接種病豬肝臟的巧克力營養(yǎng)瓊脂，從中隨機(jī)挑取20個單菌落劃線接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)，隨機(jī)挑取的細(xì)菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)沙門氏菌特有的紫色。

圖2 細(xì)菌16SRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2 以純培養(yǎng)的細(xì)菌為模板，用細(xì)菌16SRNA通用因為進(jìn)行PCR擴(kuò)增（結(jié)果見圖2），并將擴(kuò)增產(chǎn)物送長沙鉑尚生物技術(shù)有限公司測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌為沙門氏菌。測出序列如下：

2.4細(xì)菌藥物敏感性檢測結(jié)果

取分離的細(xì)菌進(jìn)行敏感性檢測，檢測方法為紙片法（K-B法），具體檢測結(jié)果見表1。由表1可見分離的沙門氏菌對頭孢曲松、恩諾沙星、氧氟沙星、氟苯尼考比較敏感，但對復(fù)方新諾明、氨芐西林、慶大霉素、丁胺卡那霉素等耐藥。

表1 分離菌藥物敏感性檢測結(jié)果

3 討論與分析

豬沙門氏菌病以1~4月齡仔豬多發(fā)，6月齡以上仔豬則較少發(fā)病。豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等血清型是引起該病的主要病原[1]。本文從發(fā)病豬肝臟以及腸系膜淋巴結(jié)分離到大量形態(tài)一致的細(xì)菌，并通過沙門氏菌顯色培養(yǎng)基以及PCR測序鑒定，證明發(fā)病豬存在大量的沙門氏菌感染。但由于細(xì)菌16SRNA基因保守性很強(qiáng)，所以未能區(qū)分是何種沙門氏菌，這將在下一步工作中進(jìn)行研究。

沙門氏菌在自然界中十分普遍，近年來，隨著中國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，沙門氏菌對養(yǎng)豬業(yè)的影響越來越嚴(yán)重。而且沙門氏菌本身就極易產(chǎn)生抗藥性，加上生產(chǎn)中抗生素的濫用，導(dǎo)致了病菌耐藥性不斷增強(qiáng)，耐藥譜擴(kuò)大，加大了對此病原的預(yù)防與治療的難度[3]。本文分離的沙門氏菌藥物敏感性檢測表明其對頭孢曲松、氟苯尼考和喹諾酮類的恩諾沙星、氧氟沙星比較敏感，對氨芐西林、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、以及氨基糖苷類藥物耐藥。程春榮[4]、黃福標(biāo)[5]、鄒立扣[6]對大量沙門氏菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查同樣表明分離的沙門氏菌對第三代頭孢類藥物、以及氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星比較敏感，而對氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物耐藥?？梢姡?dāng)前臨床上針對小豬沙門氏菌感染應(yīng)首選第三代頭孢類藥物、恩諾沙星、氧氟沙星或氟苯尼考來進(jìn)行防控，并組合成輪換用藥方案，防止細(xì)菌耐藥性過快產(chǎn)生。

[1]黃福標(biāo)，盧冰霞，劉磊，等.屠宰豬腸道沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性分析及致病性試驗[J].2012,39（1）：172-175.

[2]Run-Cheng Li,Chao-Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp.Equisimilis in Masked Palm Civet(Paguma larvata)[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(12)：2020-2023.

[3]劉芹防，崔尚金.豬沙門氏菌病病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷及防治進(jìn)展[J].豬業(yè)科學(xué),2009,（12）：24-27.

[4]程春榮，安戈，羅琦，等.145株沙門氏菌耐藥性分析[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，23(4)：256-261.

[5]黃福標(biāo)，盧冰霞，劉磊，等.屠宰豬腸道沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性分析及致病性試驗 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（1）：172-176.

[6]鄒立扣，蒲妍君，楊莉，等.四川省豬肉源大腸桿菌和沙門氏菌的分離與耐藥性分析 [J].食品科學(xué)，2012,33（13）：203-206.