婁劍鋒,雷世勇,竺俊全*,吳雄飛
(1.寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室,浙江 寧波315211;2.寧波市海洋與漁業(yè)研究院,浙江 寧波315012)
大黃魚(Pseudosciaenacrocea)隸屬鱸形目石首魚科黃魚屬,為我國重要海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一。以往因過度捕撈及近海環(huán)境污染等原因,自然資源嚴重衰退。為有效保護大黃魚資源及發(fā)展其增養(yǎng)殖業(yè),1985年福建省率先開展了官井洋大黃魚人工繁育技術(shù)攻關(guān),于1986年獲得成功后在全國推廣養(yǎng)殖。而浙江岱衢洋大黃魚的養(yǎng)殖開發(fā)相對滯后。由于岱衢洋大黃魚比官井洋大黃魚更適宜于浙江海區(qū)(特別是舟山、寧波)的養(yǎng)殖條件,而且岱衢洋大黃魚因體型、體色及肉質(zhì)與品味俱佳而歷來受消費者青睞,養(yǎng)殖開發(fā)及市場潛力極大。浙江省高度重視岱衢洋大黃魚的開發(fā),2008年寧波市岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖開發(fā)課題組在岱衢洋海域采捕野生大黃魚,經(jīng)?;?、馴養(yǎng)達性成熟8尾,以之為親本繁育與育種。由于種源材料與以往不同,其遺傳多樣性需要重新認識。
目前對大黃魚的遺傳多樣性研究已有較多報道[1-3]。國內(nèi)學(xué)者也通過形態(tài)學(xué)[4]、RAPD[5]、微衛(wèi)星[6-7]、ISSR[8]及線粒體基因[9]等方法探討了岱衢族和閩東族大黃魚群體間的遺傳差異,但利用擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)對其之間的比較研究僅見Hung等[10]報道的閩東族和岱衢族養(yǎng)殖大黃魚及其雜交子代遺傳差異分析。AFLP分子標記技術(shù)結(jié)合了RFLP的準確性和PCR的高效性,具有信息量大、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點,這體現(xiàn)在對福建官井洋大黃魚(閩東族)指紋多態(tài)性的研究[11]、對人工雌核發(fā)育大黃魚(閩東族)的鑒定及遺傳規(guī)律分析[12]、對福建閩東地區(qū)野生和養(yǎng)殖大黃魚(閩東族)的種質(zhì)資源調(diào)查[13],對采捕野生岱衢族大黃魚的種質(zhì)分析等[14]。我們運用AFLP技術(shù)對岱衢洋大黃魚(岱衢族)人工繁育二代(F2)養(yǎng)殖群體進行遺傳多樣性分析,并比較其與官井洋大黃魚(閩東族)人工繁育多代養(yǎng)殖群體間的遺傳差異,以期為岱衢洋大黃魚的育種提供理論參考。
實驗用魚于2012-04取自寧波象山港海區(qū)的大黃魚養(yǎng)殖網(wǎng)箱,岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖群體20尾(以2008年寧波市岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖開發(fā)課題組在岱衢洋海域采捕的野生大黃魚為親本,于2011-03人工繁育的第二代),個體重80~130g;官井洋大黃魚養(yǎng)殖群體20尾(以1985-1986年官井洋野捕大黃魚為親本多代人工繁育的后代,即2011世代),個體重50~80g。取每尾魚的少量肌肉組織,分別置于滅菌過的1.5mL凍存管中,放入液氮罐中帶回寧波大學(xué)實驗室,于超低溫冰箱中保存。
1.2.1 基因組DNA提取
DNA提取參照《分子克隆手冊實驗指南》[15]。取大黃魚肌肉組織約100mg,剪碎后加600μL STE裂解液、1μL RNase、5μL蛋白酶K(20mg/mL),56℃水浴1~2h至澄清,然后用改良的酚-氯仿法抽提基因組DNA。紫外分光光度計測定DNA純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。選取抽提質(zhì)量較好的DNA模板,并將之稀釋至50ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 AFLP反應(yīng)
參照Vos等[16]的方法并稍加改動。用限制性內(nèi)切酶EcoRΙ/MseΙ雙酶切,加入接頭連接后先用E-A/M-C預(yù)擴引物進行預(yù)擴增,將預(yù)擴產(chǎn)物稀釋后,用篩選出的9對選擴引物(表1)進行PCR反應(yīng)。體系為預(yù)擴模板1μL,10×Buffer 2μL,MgCl2(25mmol/L)1.2μL,dNTP(2.5mmol/L)1.6μL,EcoRΙ選擴引物(10mmol/L)0.4μL,MseΙ選擴引物(10mmol/L)0.8μL,Taq酶(5U/μL)0.5U,補足滅菌雙蒸水至20 μL。選擴PCR反應(yīng)程序為94℃2min;94℃30s,65℃30s,72℃1min(共12個循環(huán),每一循環(huán)退火溫度降低0.7℃,至56℃);94℃30s,56℃30s,72℃1min(共25個循環(huán));最后72℃延伸10min。選擴產(chǎn)物經(jīng)8%(質(zhì)量分數(shù))變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染技術(shù)顯帶,GS-800掃描儀記錄凝膠圖譜。
實驗所用的接頭、預(yù)擴引物、選擴引物均由上海生工生物工程有限公司提供。
選取AFLP指紋圖譜中清晰且一致性較強的條帶用于統(tǒng)計分析。以1和0分別表示條帶的有無,將AFLP指紋圖譜轉(zhuǎn)化為0和1數(shù)字矩陣。用POPGENE 1.32軟件計算多態(tài)位點數(shù)及其比例、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、遺傳距離和遺傳相似度等。用AMOVA 1.55軟件對群體間和群體內(nèi)的遺傳變異進行分子方差分析。聚類分析采用NTSYS 2.1軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹。
9對引物組合在2個大黃魚養(yǎng)殖群體的40尾樣品中共擴增出381條有效片段(主要分布于100~500 bp),其中多態(tài)片段為288條,多態(tài)位點比例為75.59%(表1)。每對引物擴增位點在36~51個,平均每對引物擴增出42.3個位點。其中,E-ACG/M-CAT擴增片段總數(shù)最多(51條),多態(tài)位點比例也最高(90.20%);E-AAC/M-CAA擴增片段總數(shù)最少(36條),多態(tài)位點比例也最低(63.89%)。圖1為E-ACG/M-CAT引物組合擴增的AFLP指紋圖。
表1 2個大黃魚養(yǎng)殖群體擴增位點數(shù)及多態(tài)位點比例Table 1 The number and percentage of polymorphic loci in two cultured populations of P.crocea
圖1 E-ACG/M-CAT引物組合擴增得到的AFLP指紋圖Fig.1 AFLP band patterns generated by primer combination E-ACG/M-CAT
9對引物組合在岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚養(yǎng)殖群體中分別擴增出363個和320個位點,多態(tài)位點數(shù)及多態(tài)位點比例分別為236(65.01%)和184(57.50%)。遺傳多樣性參數(shù)(表2)表明岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性高于官井洋養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。
表2 2個大黃魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Parameters of genetic diversity in two cultured populations of P.crocea
按遺傳多樣性參數(shù)(表2)估算來自2個群體間的變異為24.4%,75.6%的遺傳變異來源于群體內(nèi)不同個體間。
分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA)結(jié)果表明群體間變異占37.74%,62.26%的變異源于群體內(nèi)。顯示出2個群體的遺傳變異主要來自群體內(nèi)個體間,但群體間已有一定程度的遺傳分化(表3)。
表3 2個大黃魚養(yǎng)殖群體內(nèi)和群體間的AMOVA分析Table 3 AMOVA within and among two cultured populations of P.crocea
利用NTSYS 2.1軟件以UPGMA法對大黃魚2個群體40個個體進行聚類(圖2)。圖2中D1~D20為岱衢洋養(yǎng)殖群體,M1~M20為官井洋養(yǎng)殖群體,2個群體各自聚成一支(M1除外)。
圖2 40尾大黃魚個體構(gòu)建的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 40individuals of P.Crocea
我們利用AFLP技術(shù)對岱衢洋大黃魚人工繁育F2代與官井洋大黃魚人工繁育多代的養(yǎng)殖群體遺傳多樣性進行了分析和比較。9對選擴引物在40個大黃魚樣品中共擴增出288個多態(tài)位點,多態(tài)位點比例為75.59%,表明AFLP技術(shù)可擴增大量多態(tài)性位點,獲得豐富的遺傳信息。經(jīng)檢測,岱衢洋大黃魚人工繁育F2代養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點比例、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)均高于官井洋大黃魚人工繁育多代的養(yǎng)殖群體,表明前者的遺傳多樣性高于后者。同已報道的其他經(jīng)濟魚類相比,多態(tài)位點百分率高于張全啟等研究的牙鲆(Paralichthysolivaceus)野生群體與養(yǎng)殖群體(40.07%~46.18%)[17]、韓志強等研究的黃姑魚(Nibeaalbiflora)野生群體(51.70%~51.99%)[18]、鄭德鋒等研究的棘頭梅童魚(Collichthyslucidus Richardson)野生群體(8.82%~15.07%)[19]及巫旗生等研究的褐毛鲿(Megalonibeafusca)養(yǎng)殖群體(24.60%~25.56%)[20],低于彭志蘭等研究的舟山鮸魚(Miichthysmiiuy)群體(68.86%~72.51%)[21]。
岱衢洋大黃魚人工繁育F2代養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚人工繁育多代養(yǎng)殖群體間的遺傳分化系數(shù)Gst(0.244 0)和分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示,2個群體的遺傳變異主要來自于群體內(nèi)個體間,但群體間亦出現(xiàn)了一定程度的遺傳趨異。同時根據(jù)UPGMA法對40個個體的聚類結(jié)果可知,2個群體明顯分成2支,表現(xiàn)出較顯著的遺傳分化,這和Gst,AMOVA所得結(jié)果相符。2個群體間存在一定程度的遺傳分化,一方面可能是由于它們的起源親本的來源不同,分別來源于岱衢洋及官井洋大黃魚;另一方面,我們研究的岱衢洋大黃魚F2代養(yǎng)殖群體是經(jīng)過科學(xué)選育的群體,仍保持較高的遺傳變異,而官井洋大黃魚養(yǎng)殖群體是未經(jīng)選育的多代繁殖的后代,傳代過程中伴隨著近交衰退及遺傳漂變等作用,導(dǎo)致其遺傳多樣性降低。
Thorp[22]認為不同物種間的遺傳相似系數(shù)I為0.2~0.8(Ds=0.2~0.8),同科屬群體間I為0.1~0.5(Ds=0.5~0.9),同種群體間I為0.8~0.97(Ds=0.03~0.2)。本研究的2個養(yǎng)殖群體間的遺傳相似度為0.895 3,遺傳距離為0.110 6,表明岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚養(yǎng)殖群體仍屬于同種群體間的范圍內(nèi),沒有造成大的分化。岱衢洋大黃魚養(yǎng)殖群體和官井洋大黃魚養(yǎng)殖群體間Nm值為1.549 5,表明大黃魚2群體間存在一定程度的遺傳信息交流。
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