適于沙漠地下水培養(yǎng)的耐碳酸氫鈉產(chǎn)油微藻

席瑋芳 高 宏 蘭 波 徐旭東 孔任秋

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適于沙漠地下水培養(yǎng)的耐碳酸氫鈉產(chǎn)油微藻

席瑋芳1, 2高 宏1蘭 波1徐旭東1孔任秋1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

產(chǎn)油微藻; 培養(yǎng); 沙漠地下水; 18S rDNA

能源危機是全世界面臨的共同問題, 采用可再生能源替代化石能源是出路之一。生物柴油作為一種清潔可再生能源備受矚目[1—3]。目前, 生物柴油主要以大豆和油菜、油棕和麻風(fēng)樹等油料植物以及動物油脂、廢餐飲油等作為原料。但是動物油脂、廢餐飲油原料有限, 而油料植物生產(chǎn)油脂存在占地面積大、生產(chǎn)周期長等缺點, 不宜作為未來生物柴油的主要來源。相比之下, 產(chǎn)油微藻具有生長周期短、單位面積產(chǎn)量高等優(yōu)點[4], 被認為是生物柴油的下一代原料。由于我國耕地面積逐年減少[5], 北方土地沙漠化嚴重[6], 利用可耕種土地來培養(yǎng)產(chǎn)油藻顯然不符合我國國情, 利用沙漠和鹽堿灘涂等不適于耕種的土地作為產(chǎn)油藻規(guī)模化培養(yǎng)基地應(yīng)是我們的選擇。大規(guī)模培養(yǎng)微藻時, 會利用當(dāng)?shù)氐叵滤蚱渌刺砑訜o機元素配制培養(yǎng)基, 當(dāng)?shù)氐乃|(zhì)可能影響微藻的生長和產(chǎn)油。因此, 在微藻工業(yè)化生產(chǎn)前, 有必要利用當(dāng)?shù)氐乃渲门囵B(yǎng)基進行產(chǎn)油藻種篩選。

庫布齊沙漠是我國第七大沙漠, 西、北、東三面均以黃河為界, 南部為構(gòu)造臺地, 中部為風(fēng)成沙丘, 北部為河漫灘地[7]。地下水主要為HCO3-Na、HCO3-Na×Mg型水, 總?cè)芙夤腆w為(0.69—0.97) g/L, 總硬度為(267.15— 3561.45) mg/L[8], 水質(zhì)鹽度偏高。在庫布齊沙漠地區(qū)的東北部建有達拉特旗荒漠藻綜合治沙技術(shù)試驗站, 本文將從內(nèi)蒙古一些鹽堿地區(qū)采集分離得到的一些微藻, 利用試驗站內(nèi)的地下水配制培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和油脂含量測定, 篩選生長較快、含油量較高并且可以耐受較高濃度碳酸氫鈉的藻株, 以進一步在庫布齊沙漠地區(qū)進行開放式培養(yǎng)研究。

1 材料與方法

1.1 藻種的來源和培養(yǎng)

藻種來自本實驗室從內(nèi)蒙古各鹽堿地區(qū)采集并分離純化得到的46個藻株。使用鄂爾多斯達拉特旗荒漠藻綜合治沙技術(shù)試驗站(位于庫布齊沙漠地區(qū)的東北部40°22￠23.42N 109°50￠57.72E)井水配制的補加0.1 mol/L NaHCO3的BG11[9]培養(yǎng)基(以下稱為地下水高堿BG11)培養(yǎng)。

1.2 初步篩選

將各藻株接種于含100 mL地下水高堿BG11培養(yǎng)基的三角瓶中, 初始接種時的光密度值(OD680, 使用MAPADA V-1200 spectro photometer測量, 比色皿光程為10mm)為0.05, 在單側(cè)光強為50 μE/(m2·s)、溫度為30℃下靜置培養(yǎng), 每天搖勻3次。觀察各藻株的生長情況, 培養(yǎng)至20d, 測定各藻株OD680值以比較細胞濃度, 收集相等量的藻液提取總脂。

藻細胞的總脂利用氯仿/甲醇萃取的方法[10]提取。薄層層析參照文獻[11]進行。在薄層層析板(Silica gel 60 F254, Merk KgaA Darmstadt, German)的一端約0.5 cm處點樣。以0.02 mg三油酸甘油酯(triolein)標準品(購自Sigma公司)作為參照。展層劑體系為正己烷︰乙醚︰乙酸混合溶液(體積比為70︰30︰1), 層析結(jié)束后利用碘蒸氣對硅膠板進行染色[12]。

1.3 耐高堿藻的生長及總脂含量測定

將各藻株接種于含有400 mL地下水高堿BG11培養(yǎng)基的三角瓶中, 每株藻設(shè)置三個平行, 初始接種時的680為0.05, 在培養(yǎng)溫度為30℃、單側(cè)光強為100 μE/(m2·s)條件下通空氣培養(yǎng), 隔天測量680, 繪制生長曲線。當(dāng)藻液的680超過量程時, 使用ddH2O將其稀釋一定的倍數(shù)之后再測量, 使測量值在0.1—1.0范圍內(nèi), 然后根據(jù)稀釋倍數(shù)換算得到實際680值。培養(yǎng)20d后, 收集藻液, 凍干后取100 mg干藻粉提取總脂?？傊奶崛⒄瘴墨I[10]進行, 利用稱重法計算總脂含量。

1.4 7株產(chǎn)油藻的顯微照片及18S rDNA序列分析

取藻液于載玻片上, 在Olympus BX41型光學(xué)顯微鏡下進行觀察、照相。藻株的基因組DNA用CTAB法[13]提取, 以藻株的基因組DNA為模板, 以通用引物18S-1 (5′-tggttgatcctgccagtagtc-3′)和18S-2(5′-tgatccttctgca-gg-tt cacc-3′)[11]進行PCR擴增獲得相應(yīng)18S rDNA片段。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳和回收試劑盒(購自BioFlux公司)分離、回收和純化DNA片段, 分別克隆到pMD18-T(購自Takara公司)載體上, 送測序。18S rDNA序列均已提交NCBI GenBank。DNA序列用MEGA 5.0進行對位排列比對, 比對中采取默認設(shè)置, 并對比對結(jié)果進行手工調(diào)整。以三角褐指藻()的18S rDNA作為外類群, 使用軟件MEGA 5.0構(gòu)建鄰接樹、最大簡約樹和最大相似樹。

2 結(jié)果

2.1 藻種初篩

將從鄂爾多斯地區(qū)鹽堿地分離的46株耐堿產(chǎn)油藻在地下水高堿BG11中培養(yǎng), 篩選出15株生長較快的藻株, 提取總脂進行薄層層析比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號為LB1、NMX451、LB65、LB75和LB96共5株藻的甘油三酯含量明顯高于其他藻株, 而LB39、LB52、LB74和LB80明顯較低; 其余6株藻LB53、LB60、LB71、LB77和LB89的甘油三酯含量相當(dāng), 但LB77和LB89生長慢。顯微鏡觀察又發(fā)現(xiàn)LB96藻種不純, 因此選擇LB1、NMX451、LB65、LB75、LB53、LB60和LB71 共7株藻用于進一步試驗(見圖1有下劃線的藻株)。

2.2 7藻株的生長及總脂含量的測定

將以上選出的7藻株在含有400 mL地下水高堿BG11的三角瓶中培養(yǎng)生長, 生長曲線如圖2, 總脂含量如表1。生長最快的是LB65, 其總脂含量為30%左右; LB71生長次之, 總脂含量為32%左右。LB53、NMX451和LB60生長較慢, 其中LB60的總脂含量卻是7株藻中最高, 為36%±2.06%, LB53和NMX451藻株的總脂均低于30%。LB1和LB75生長速率中等, 總脂含量均高于34%。

箭頭所指為甘油三酯; LB1-96, 15株耐高堿綠藻; S. 甘油三酯標樣; 帶下劃線的藻株用于進一步研究

The arrow points to triacylglycerol; LB1-96, 15 NaHCO3-tolerant algal strains; S, triolein. The underlined algal strains were used in further investigations

表1 7株藻在沙漠地下水高堿BG11中的的總脂含量

2.3 7株藻的形態(tài)觀察和18S rDNA序列分析

通過光學(xué)顯微鏡觀察, LB1、LB65和LB75的細胞均為球狀, 直徑為(3—5) μm; LB53、LB60和LB71的細胞形態(tài)成新月形或梭形, 長(6—9) μm, 寬為(2—5) μm; 唯獨只有NMX451為橢球形, 長(7—9) μm, 寬為(5—7) μm, 常見2或4個細胞并排分布, 細胞表面具刺或鞭毛狀附屬物(圖3)。對這些藻株的18S rDNA 序列在GenBank中比對, 找到這些藻的相似序列, 以三角褐指藻作為外類群構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。不同系統(tǒng)分析方法構(gòu)建的18S rDNA 系統(tǒng)樹具有相似的拓撲結(jié)構(gòu)(圖4)。發(fā)現(xiàn)LB1、LB65和LB75藻株聚成一簇, 均在小球藻屬分支之中; LB53、LB60、LB71和LB96與單針藻種類聚成一簇; NMX451則與鏈帶藻種類聚在一起。結(jié)合顯微觀察和分子系統(tǒng)進化樹, 可以確定LB1、LB65和LB75為小球藻屬的種類, LB53、LB60和LB71為單針藻屬的種類, NMX451為鏈帶藻屬的種類。

3 討論

產(chǎn)油微藻作為生產(chǎn)生物柴油的源料有若干優(yōu)勢, 但在目前技術(shù)條件下其生產(chǎn)成本過高, 仍未在生產(chǎn)中得到應(yīng)用?，F(xiàn)有的適合開放式規(guī)模養(yǎng)殖的藻種, 包括螺旋藻、杜氏鹽生藻和其他一些海洋藻類, 其共同點是可以在較高鹽度或pH的培養(yǎng)基中生長[14]。另一方面, 我國耕地面積短缺, 應(yīng)該利用好沙漠地區(qū)發(fā)展微藻產(chǎn)業(yè)[15]。我們利用在鄂爾多斯鹽堿地采集分離的藻種, 以達拉特旗地下水配置的培養(yǎng)液進行產(chǎn)油藻篩選, 獲得了一些適應(yīng)當(dāng)?shù)厮|(zhì)的藻株。本研究所篩選出的7株藻均為耐堿產(chǎn)油藻, 在大規(guī)模培養(yǎng)時更容易具有不易污染的優(yōu)勢。同時, 培養(yǎng)液中存在碳酸氫鈉還有利于碳的固定和利用, 可以提高生長速率, 有利于生物質(zhì)的積累。

從7株微藻的形態(tài)和18S rDNA序列可以鑒定出, 有3株隸屬于小球藻屬, 2株屬于單針藻, 還有1株是鏈帶藻。鏈帶藻NMX451是我們最早分離得到的一株耐受碳酸氫鈉的產(chǎn)油藻, 在1 m2的跑道池(100 L體積培養(yǎng)液)小規(guī)模開放式培養(yǎng)及絮凝采收研究已在另文發(fā)表[16]。該藻株在本文描述的生長條件下與以前用武漢地區(qū)自來水配置培養(yǎng)液的條件下總脂水平相當(dāng), 一般在26%到27%之間。在這些藻株中, 除了兩株生長慢總脂含量也較低的LB53和NMX451之外, 其余5株藻顯示出生長與總脂含量負相關(guān)的趨勢。LB65生長最快, 總脂含量在這5株中最低; LB60總脂含量最高, 但生長最慢; LB1、LB71和LB75生長較快且總脂含量較高。通過調(diào)整培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件, 有可能保持LB60較高的含油量而提高其生長, 保持LB65較快的生長速度而提高其含油量, 其余藻株的生長產(chǎn)油能力也可能得到全面的提高。本研究結(jié)果顯示,從當(dāng)?shù)佧}堿地藻種資源中, 有可能篩選出適合于沙漠地區(qū)地下水水質(zhì)特征的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)油微藻。

標尺: 10 μm; 1. LB1, 2. NMX451, 3. LB53, 4. LB60, 5. LB65, 6. LB71, 7. LB75

Scale bar: 10 μm. 1. LB1, 2. NMX451, 3. LB53, 4. LB60, 5. LB65, 6. LB71, 7. LB75

節(jié)點處的數(shù)字為支持率: 鄰接樹(1000次重復(fù))、最大相似樹(100次重復(fù))和最大簡約樹(1000次重復(fù)); 只顯示節(jié)點上支持率大于50的值。藻株后為NCBI GenBank號

Numbers at the nodes indicate support values: neighbor joining (1000 bootstrap replicates), maximum likelihood (100 bootstrap replicates) and maximum parsimony (1000 bootstrap replicates). Only values above 50% were shown. NCBI GenBank accession numbers are indicated following each algal strain number

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Na2HCO3-TOLERANT OIL-PRODUCING MICROALGAE THAT ARE SUITABLE FOR CULTIVATION WITH DESERT GROUNDWATER

XI Wei-Fang1, 2, GAO Hong1, LAN Bo1, XU Xu-Dong1and KONG Ren-Qiu1

(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Oil-producing microalgae; Cultivation; Desert groundwater; 18S rDNA

10.7541/2015.54

Q949.2

A

1000-3207(2015)02-0414-05

2014-04-14;

2014-06-12

科技基礎(chǔ)性工作專項課題中國產(chǎn)油微藻調(diào)查(2012FY112900-04)資助

席瑋芳(1989—), 男, 江西上饒人; 碩士研究生; 主要從事藻類生物技術(shù)研究。E-mail: xiweifang@126.com

孔任秋, E-mail: kongr@ihb.ac.cn