小分子化合物Me6TREN促進(jìn)小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞的增殖

楊舒 ，張靜，王思涵，范增，王靜雪，韓毅，田宇，何麗娟，陳琳，岳文，李艷華，裴雪濤

1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室，北京 100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510005

造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）是一群具有長(zhǎng)期自我更新及定向分化成各系血細(xì)胞能力的細(xì)胞[1]。臨床上，常采用造血干/祖細(xì)胞移植重建骨髓損傷患者的造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，造血干/祖細(xì)胞移植被用于治療多種疾病，例如白血病等惡性血液病、重型再生障礙性貧血、自身免疫性疾病、急性放射病等[3]。

移植的造血干/祖細(xì)胞能否成功重建受者的造血及免疫系統(tǒng)取決于多方面的因素，如移植的造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量、造血干/祖細(xì)胞的歸巢效率、免疫排斥反應(yīng)等[3-4]。目前，臨床上主要采集外周血中的造血干/祖細(xì)胞作為移植細(xì)胞來(lái)源。在正常情況下，外周血中的造血干/祖細(xì)胞數(shù)量有限，為獲得足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞，需要使用動(dòng)員劑如粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）將骨髓中的造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員至外周血循環(huán)中[5]。我們新發(fā)現(xiàn)的小分子化合物Me6TREN（以下簡(jiǎn)稱Me6）也具有將骨髓造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員至外周血的能力，有望成為一類新型的造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員劑候選藥物[6]。近年來(lái)，臍帶血造血干細(xì)胞移植在臨床上的應(yīng)用逐年增多[7-8]。但臍帶血中的造血干/祖細(xì)胞數(shù)量較少，一份臍帶血不能滿足成年病人的治療細(xì)胞量，因此需要對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)獲得足夠數(shù)量的造血干/祖細(xì)胞[9]，目前已有研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展體外擴(kuò)增的造血干/祖細(xì)胞移植病人的臨床試驗(yàn)[10]。優(yōu)化造血干細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系，有助于進(jìn)一步推動(dòng)臍帶血來(lái)源的造血干/祖細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

Me6 是一類飽和胺類化合物，屬于一類新型醫(yī)藥中間體，可用于制備遠(yuǎn)螯聚合物的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）配體。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，單次皮下注射Me6 能將小鼠骨髓中的造血干/祖細(xì)胞快速有效地動(dòng)員至外周血中[6]。傳統(tǒng)的造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員劑G-CSF在動(dòng)員造血干/祖細(xì)胞的同時(shí)，能促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增[11]，而化合物Me6 是否也能夠促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增尚不明了。為此，我們檢測(cè)了皮下注射Me6 的小鼠骨髓內(nèi)造血干/祖細(xì)胞數(shù)量及比例的變化，并利用體外培養(yǎng)體系進(jìn)一步考察了該化合物是否影響造血干/祖細(xì)胞的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57BL/6 小鼠，體重18～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK-（京）2012-0001；飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）和Me6組。檢測(cè)前12 h，對(duì)Me6組C57BL/6小鼠皮下注射Me6，劑量為5 mg/kg；對(duì)照組注射PBS。

Me6TREN 購(gòu)自Sigma 公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自BD公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；流式抗體Lineage APC-Cy7（CD3，CD11b，Ter-119，B220，Ly-6G）、Sca-1 PE-Cy7、c-Kit Alexa Fluor 700 均購(gòu)自eBioscience 公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）、重組人血小板生成素（TPO）、白細(xì)胞介素3（IL-3）、白細(xì)胞介素6（IL-6）均購(gòu)自Peprotech公司；半固體集落培養(yǎng)基M3434購(gòu)自StemCell公司。

1.2 小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離培養(yǎng)

用頸椎脫臼法處死小鼠后，置于75%酒精中消毒，在無(wú)菌環(huán)境下分離小鼠股骨，用1 mL 注射器吸取培養(yǎng)液，將骨髓細(xì)胞沖出至離心管中，2000 r/min離心5 min，得到細(xì)胞沉淀，用5 mL PBS重懸細(xì)胞，加到等體積的淋巴細(xì)胞分離液上層，2000 r/min 離心20 min（離心機(jī)調(diào)至慢升慢降），收集中間層細(xì)胞，用PBS洗滌2次，得到單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞種于含有500 μL 培養(yǎng)基（α-MEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，SCF 50 ng/mL，TPO 10 ng/mL，IL-3 10 ng/mL，IL-6 10 ng/mL）的24 孔低吸附板，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞集落形成能力的檢測(cè)

將小鼠半固體集落培養(yǎng)基（M3434）加入24孔低吸附板中，避免產(chǎn)生氣泡，然后將細(xì)胞以5×103/孔的密度接種到24孔板，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7 d后，在顯微鏡下對(duì)形成的造血集落形成單位（colony-forming unit，CFU）進(jìn)行計(jì)數(shù)；14 d 后，對(duì)高增殖潛能集落形成單位（high-proliferative-potential CFU，HPP-CFU）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)

將分離得到的小鼠骨髓細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液處理后，取2×106細(xì)胞，用100 μL PBS 重懸至1.5 mL EP管中，加入抗體（Lineage、Sca-1、c-Kit），充分混勻后置于旋轉(zhuǎn)混合器上，4℃避光孵育30 min，然后用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，800 r/min 離心5 min，用300 μL PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管中，用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 小分子化合物Me6 對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞集落形成能力的影響

C57BL/6 小鼠皮下注射Me6，劑量為5 mg/kg，12 h后分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行集落形成能力的檢測(cè)。7 d后，對(duì)2組骨髓細(xì)胞的造血CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)比較，由結(jié)果（圖1A）看出，與Con 組小鼠（87.67±4.096）相比，Me6 組小鼠（108.0±2.646）骨髓單個(gè)核細(xì)胞所形成的集落數(shù)顯著增加（P=0.014）；14 d后，對(duì)HPP-CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)比較，由結(jié)果（圖1B）看出，Me6組（18.75±1.109）小鼠HPP-CFU的數(shù)量較Con 組（14.33±0.667）也明顯增加（P=0.0269）。這組結(jié)果表明Me6 能增加小鼠骨髓中造血祖細(xì)胞的數(shù)量。

2.2 小分子化合物Me6 對(duì)小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞的比例及數(shù)量的影響

圖1 Me6能增加小鼠骨髓中造血祖細(xì)胞的數(shù)量

將分離得到的Con組和Me6組小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，考察造血干/祖細(xì)胞的表面標(biāo)志lin-Sca-1+c-Kit+（LSK）的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與Con組（0.1412±0.01535）小鼠相比，Me6 組（0.2451±0.04030）小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞的比例顯著增加（P=0.0337）。

2.3 小分子化合物Me6 對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的影響

體外分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，在培養(yǎng)體系中添加小分子化合物Me6，培養(yǎng)4 d 后，對(duì)Con 組和Me6組細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果（圖3）顯示，2組細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)沒(méi)有顯著差別（P=0.3769）。

2.4 小分子化合物Me6 對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的集落形成能力的影響

圖2 Me6能增加小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞的比例

圖3 培養(yǎng)4 d的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量

將在體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分為Con組和Me6培養(yǎng)組，取培養(yǎng)4 d的細(xì)胞進(jìn)行集落形成能力的檢測(cè)。7 d后，對(duì)Con和Me6兩組細(xì)胞的造血CFU 進(jìn)行計(jì)數(shù)比較，由結(jié)果（圖4A）看出，與Con組（81.75±3.568）相比，Me6 組（120.8±5.023）所形成的集落數(shù)增加（P=0.0007）；14 d 后，對(duì)HPP-CFU 進(jìn)行計(jì)數(shù)比較，由結(jié)果（圖4B）看出，Me6 組（19.67±1.202）HPP-CFU的數(shù)量較Con組（14.25±1.436）也明顯增加（P=0.0406）。這組結(jié)果表明化合物Me6能增加體外培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中造血祖細(xì)胞的數(shù)量。

2.5 小分子化合物Me6 對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞增殖能力的影響

將在體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分為Con 組和Me6 組，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析造血干/祖細(xì)胞（lin-Sca-1+c-Kit+）的增殖情況。檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，與Con 組（0.009625±0.001216）相比，Me6 組（0.01515±0.0007304）造血干/祖細(xì)胞中Ki-67的比例增加（P=0.0176）。這說(shuō)明化合物Me6能促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞的增殖。

3 討論

造血干/祖細(xì)胞是研究最為深入的成體干細(xì)胞，它具有自我更新以及分化成各系成熟血細(xì)胞的能力。在成體內(nèi)，造血干/祖細(xì)胞主要定居于骨髓中。骨髓中的造血干/祖細(xì)胞不斷地增殖分化形成各種血細(xì)胞，并和各種血細(xì)胞不斷地在骨髓和外周血之間循環(huán)[1-2]。如今，造血干/祖細(xì)胞移植可以用來(lái)治療多種血液疾病，但由于獲得的造血干/祖細(xì)胞數(shù)量有限（如臍帶血中的造血干/祖細(xì)胞數(shù)量較少），直接影響了移植的效率，因此需要對(duì)造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增[4]。當(dāng)前用于造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的方法很多，包括細(xì)胞因子、高通量篩選得到的小分子化合物、基質(zhì)細(xì)胞等[7,12]。體外擴(kuò)增使細(xì)胞脫離了體內(nèi)的微環(huán)境，可能會(huì)增加細(xì)胞的凋亡；此外，擴(kuò)增可以使細(xì)胞數(shù)量增多，但有可能增加的是成熟細(xì)胞而不是干細(xì)胞，擴(kuò)增后造血干/祖細(xì)胞的長(zhǎng)期植入能力可能并未得到提高[13]。因此，對(duì)造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增，需要的不僅僅是表型，還有功能性的提高，使其移植后能快速有效地重建患者的造血和免疫系統(tǒng)。

圖4 培養(yǎng)4 d的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中造血祖細(xì)胞的數(shù)量

圖5 培養(yǎng)4 d的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞的Ki-67+比例

我們的前期研究表明Me6 具有很好的動(dòng)員作用，能將骨髓中造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員至外周血中，增加外周血中造血干/祖細(xì)胞的比例及數(shù)量[6]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Me6還能促進(jìn)小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞的增殖。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠皮下注射Me6，12 h 后檢測(cè)小鼠的骨髓，可發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞的集落形成能力增強(qiáng)，并且造血干/祖細(xì)胞的比例及數(shù)量也有所增加。這些結(jié)果提示該化合物在動(dòng)員造血干/祖細(xì)胞的同時(shí)，可能促進(jìn)了骨髓造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增。我們的芯片檢測(cè)結(jié)果也提示化合物可能調(diào)節(jié)了Notch 信號(hào)通路，文獻(xiàn)報(bào)道該通路具有促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能力[14-16]。為進(jìn)一步確定化合物Me6 是否具有體外促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能力，我們?cè)隗w外分離培養(yǎng)了小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，向培養(yǎng)體系中加入化合物Me6，培養(yǎng)4 d后Me6組細(xì)胞的集落形成能力及增殖的造血干/祖細(xì)胞的比例都增加了，這些結(jié)果提示Me6 具有體外促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能力。對(duì)于小分子化合物Me6 是否能促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的長(zhǎng)期擴(kuò)增及其可能的機(jī)制仍須進(jìn)行深入的研究。

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