顏賀欣,蘇威,楊丹,高鵬,夏玉軍,單守勤
1.青島大學(xué),山東 青島 266071;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;3.濟南軍區(qū) 第一療養(yǎng)院,山東青島 266071
伴隨科技的發(fā)展,核技術(shù)的廣泛應(yīng)用和放射醫(yī)學(xué)的發(fā)展,電離輻射對人類產(chǎn)生了不可避免的損傷。肝臟是輻射的敏感器官,其放射敏感性僅次于骨髓、淋巴、胃腸組織、性腺、胚胎和腎。輻射會造成肝臟形態(tài)、代謝功能、作用機制的改變,以及肝內(nèi)細(xì)胞的病理、生理、生物膜、酶活性和肝微循環(huán)等的改變[1]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSC)是多能干細(xì)胞的一種,它具有分化度低、有絲分裂程度低、DNA分離不對稱[2]等特征,以及細(xì)胞更新、組織再生、免疫調(diào)節(jié)和多向分化的潛能[3]。應(yīng)用具有強大功能的UCMSC,在輻射性肝損傷的治療中取得很大的研究成果,是輻射醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中治療的理想種子。在本研究中,我們通過對小鼠全身進行X 線輻射,制作輻射損傷的模型,經(jīng)尾靜脈注射UCMSC 懸浮液后,檢測小鼠肝細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化及肝細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶的活性、丙二醛含量的改變,研究人UCMSC 對輻射性肝損傷的防護作用。
健康清潔級SD小鼠80只,體重(22±2)g,來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心;臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(DiL 標(biāo)記)來自清華大學(xué)深圳研究生院。測定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
將小鼠隨機分為4組,每組20只。除正常組外,采用醫(yī)用直線加速器產(chǎn)生的X線對其余各組小鼠進行全身照射,波源距皮膚100 cm,照射劑量2 Gy。照射完畢,隨機分組標(biāo)記,按如下分組,分別于小鼠尾靜脈注射1 mL 處于對數(shù)生長期的第3 代人UCMSC懸液或等體積的生理鹽水:
①正常組:不照射,12 和24 h 僅尾靜脈注射生理鹽水;②放射組:照射后12 和24 h 僅尾靜脈注射生理鹽水;③普通組:照射后12 和24 h 分別尾靜脈注射UCMSC 懸浮液和生理鹽水;④加強組:照射后12和24 h后分別尾靜脈注射UCMSC懸浮液。
無菌條件下取出肝組織,準(zhǔn)確稱取重量,按照重量(g)∶體積(mL)的比例加入9 倍體積生理鹽水,剪碎組織,冰水浴制備勻漿,2500~3000 r/min 離心10分鐘,上清即為10%勻漿。
觀察小鼠受輻射前后的活動量、精神狀態(tài)、食欲狀況,并記錄。
經(jīng)干預(yù)后處死小鼠,取小鼠肝臟,用4%甲醛固定做石蠟切片,經(jīng)石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色,觀察肝臟的病理形態(tài)變化。
取小鼠肝組織勻漿與檢測試劑按比例混合,漩渦混勻器混勻,試管口用保鮮薄膜扎緊,用針頭刺一小孔,95℃水浴40 min,取出后流水冷卻,測定D532nm值,計算樣品中MDA的含量。
取稀釋的小鼠肝組織勻漿與檢測試劑混合于96 孔酶標(biāo)板混勻,37℃孵育20 min,于酶標(biāo)儀上測定D550m值,計算樣品中SOD的活力。
與正常組小鼠比較,輻射后放射組的小鼠活動量明顯減少,精神較差,食欲減退。經(jīng)注射UCMSC懸浮液治療的小鼠與放射組小鼠比較,活動量有所增加,精神較好,食欲增強。
正常肝組織肝索排列有序,肝竇無充血和擴大,肝細(xì)胞無水腫變性和壞死,中央靜脈管壁完整,管腔無擴大、變窄阻塞,周圍無膠原纖維沉積(圖1A)。與正常組比較,放射組肝細(xì)胞有不同程度的水腫、變性,中央靜脈周圍明顯有炎性細(xì)胞浸潤,周圍網(wǎng)狀纖維增多,變窄、堵塞(圖1B)。與放射組比較,注射UCMSC 懸浮液治療的普通組小鼠肝小靜脈周圍網(wǎng)狀纖維減少,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤有所減輕,周圍網(wǎng)狀纖維減少;加強組中央靜脈管壁周圍膠原纖維沉積大幅減少(圖1C、D)。
圖1 各組小鼠肝組織的病理學(xué)形態(tài)
2.3.1 小鼠肝細(xì)胞中SOD的活性 輻射組與正常對照組比較,SOD 活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=41.89~182.96,t=10.79~22.03,*P<0.01)。普通組與輻射組比較,SOD活性有所升高,有明顯的改善作用(F=41.89~182.96,t=4.78~13.12,**P<0.01)。加強組與普通組比較,SOD 活性有所升高(F=41.89~182.96,t=1.68~10.15,***P<0.05)。見表1、圖2。
2.3.2 小鼠肝細(xì)胞中MDA 的含量 輻射組與正常對照組比較,MDA 含量顯著升高(F=158.441~632.751,t=12.13~44.22,*P<0.01)。普通組與輻射組比較,MDA 含量有所降低(F=158.441~632.751,t=5.44~15.00,**P<0.01)。加強組與普通組比較,MDA含量降低(F=41.89~182.96,t=10.83~26.02,***P<0.05)。見表2、圖3。
電離輻射可使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基,如超陰離子、羥自由基、過氧化氫等[4]。這些產(chǎn)生的活性自由基可直接或間接破壞機體細(xì)胞的生物膜和核酸[5],可致DNA 鏈斷裂,使組織器官形態(tài)、代謝功能、作用機制及組織細(xì)胞內(nèi)酶活性和微循環(huán)等發(fā)生改變,若不及時清除自由基,會使組織發(fā)生更為嚴(yán)重的物理或化學(xué)損傷[6-7]。
圖2 小鼠肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性的改變
放射性肝損傷常見于全身放射性損傷(核泄漏、核爆炸等核事故的發(fā)生),以及腹部、盆腔腫瘤局部放射治療時產(chǎn)生的輻射損傷。放射性肝損傷導(dǎo)致細(xì)胞變性、凋亡、壞死,肝酶系紊亂,生物膜破壞,代謝障礙,嚴(yán)重時引起肝功能衰竭。在正常情況下,人體內(nèi)的自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中,而自由基的清除主要依靠抗氧化酶的作用。SOD是一種普遍存在于有機生物體內(nèi)的金屬酶,它具有超強的氧化作用,可催化自由基發(fā)生歧化反應(yīng),清除自由基,從而保護受損細(xì)胞,維持機體的氧化和抗氧化反應(yīng)的動態(tài)平衡。MDA是過氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物,對機體細(xì)胞有攻擊力,檢測MDA的含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度,從而間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷情況。MDA與SOD測定相互配合,SOD活力的高低間接反映了清除氧自由基的能力,而MDA含量的高低又間接反映了機體細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度。
圖3 小鼠肝細(xì)胞內(nèi)MDA含量的改變
表1 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的SOD活性(U/mg,,n=5)
表1 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的SOD活性(U/mg,,n=5)
第1 d和第2 d方差不齊,采用Dunnett T3檢驗;第7 d和第14 d方差齊,采用LSD檢驗;輻射組與正常組比較*P<0.01,普通組與輻射組比較**P<0.01,加強組與普通組比較***P<0.05
表2 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量(nmol/mg,,n=5)
表2 輻射損傷期各階段受照小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的MDA含量(nmol/mg,,n=5)
方差不齊,采用Dunnett T3檢驗;輻射組與正常組比較*P<0.01,普通組與輻射組比較**P<0.01,加強組與普通組比較***P<0.05
間充質(zhì)干細(xì)胞是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞,主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,具有自我復(fù)制和多向分化的潛能,并且可以自我更新,在特定條件下分化增殖為多種組織和器官的細(xì)胞。目前,我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肺、肝、胰腺等組織,以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質(zhì)干細(xì)胞,用得最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。成人骨髓供體難求,很難獲取,數(shù)量極少,且可對供體造成不可避免的創(chuàng)傷,易感染;胎兒的骨髓干細(xì)胞傳代增殖能力雖強,但因胚胎來源問題備受爭議[8]而受到限制;而臍血干細(xì)胞易于獲取,來源廣泛,生物特性穩(wěn)定,增殖分化能力旺盛,對供體無任何傷害,是理想的種子細(xì)胞。因此,本實驗選取UCMSC進行。
本試驗通過制作石蠟切片,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟的病理形態(tài),發(fā)現(xiàn)輻射后放射組肝細(xì)胞不同程度水腫、變性,中央靜脈周圍明顯有炎性細(xì)胞浸潤,周圍網(wǎng)狀纖維增多,變窄、堵塞,提示接受全身輻射的小鼠肝臟存在輻射損傷,說明模型制作成功。經(jīng)注射UCMSC懸浮液治療的小鼠肝細(xì)胞水腫減輕,小靜脈周圍網(wǎng)狀纖維減少,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤有所減輕,中央靜脈管壁周圍膠原纖維沉積大幅減少。經(jīng)組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評分表明有顯著性差異。這證實UCMSC 對肝臟組織具有積極的防護抗損傷作用。研究表明,UCMSC 移植進入受試動物肝臟后,有分化為肝細(xì)胞的趨勢[9],并能間接刺激正常肝細(xì)胞再生,促進損傷肝細(xì)胞的修復(fù),改善肝細(xì)胞功能[10]。肝細(xì)胞內(nèi)酶的變化顯示,放射組與正常組比較MDA值顯著增高,SOD 值顯著下降,證明了自由基的產(chǎn)生。而經(jīng)注射UCMSC 懸浮液治療后MDA 值顯著下降,SOD值顯著增高(P<0.01),證明UCMSC能清除自由基,減輕自由基所致的肝細(xì)胞損傷。
UCMSC 對輻射性肝損傷的修復(fù)再生作用的機制非常復(fù)雜:一是某些特殊細(xì)胞因子如SDF-1、TGF-β、MIP-1α、MCP-I 等引導(dǎo)UCMSC 到肝臟損傷的局部組織[11],在組織局部適宜環(huán)境條件下誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞;二是到達(dá)組織局部的UCMSC在刺激因子[12]的作用下分化為肝細(xì)胞;三是UCMSC可以分泌細(xì)胞因子(IL-6)[13]刺激局部肝損傷組織細(xì)胞的修復(fù)??偠灾?,UCMSC 移植具有清除自由基、減輕肝損傷和促進損傷肝細(xì)胞修復(fù)再生的作用,能夠有效改善肝臟功能,但注射劑量、時間及次數(shù)可能會影響治療效果。由于間接或直接因素的作用刺激局部損傷組織細(xì)胞的修復(fù)再生,應(yīng)用后的療效評價會直接影響臨床應(yīng)用前景。為使UCMSC 成為臨床理想的治療手段,其具體機制機理還有待進一步探究。
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