小花清風藤水提物體內(nèi)抗流感病毒的研究

曲新艷，張會敏，張曉娟，史鵬輝，周喆，王升啟

1.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850；2.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355

小花清風藤（Sabia parvifloraWall，SPS）為清風藤科清風藤屬藤本植物，主要分布于云南、廣西、貴州等地。貴州產(chǎn)小花清風藤為布依族、苗族的民間用藥，具有清熱利濕、祛風止痛的功效，民間俗稱小黃藥、黃腫藥、黃眼藥、雅希強，據(jù)報道小花清風藤在貴州少數(shù)民族地區(qū)常用于治療肝炎，且療效顯著[1]。近年來，對小花清風藤的現(xiàn)代研究陸續(xù)有報道，如劉易蓉等發(fā)現(xiàn)小花清風藤提取物對小鼠四氯化碳和撲熱息痛所致肝損傷有保護作用[2]；楊瑩等發(fā)現(xiàn)小花清風藤膠囊對小鼠四氯化碳和D-半乳糖所致肝損傷有一定的保護作用[3]。但尚未見有關(guān)小花清風藤提取物對流感病毒作用的研究報道[4]。本實驗室在篩選抗流感病毒中藥的初步研究中發(fā)現(xiàn)小花清風藤具有明顯的抗流感病毒作用，因此，我們以流感病毒感染小鼠為模型，對小花清風藤水提物體內(nèi)抗流感病毒作用進行了系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級BALB/c 小鼠，雄性，體重17～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001；甲型流感病毒亞型FM1 小鼠肺適應(yīng)株（A/FM/1/47）為本實驗室保存病毒株。

小花清風藤水提物（取適量小花清風藤藥材，粉碎，第一次用8倍量水煎煮40 min，第二次用6倍量水煎煮40 min，合并2 次水煎煮液，濃縮后4℃保存?zhèn)溆茫涣姿釆W司他韋（購自武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司）；戊巴比妥鈉（購自Sigma 公司）；甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法）（購自北京普利耐特生物科技有限公司）；TRIzol（購自Sigma公司）。

1.2 小花清風藤水提物對流感病毒性肺炎小鼠生存率、生存時間的影響

取BALB/c 小鼠60 只，隨機分成正常組、模型組、磷酸奧司他韋組（i.g，10 mg/kg）、小花清風藤水提物低、中、高3個劑量組（i.g，3.25、6.5、13 g/kg），每組10 只。除正常對照組外，造模前，將凍存的流感病毒于冰上溶解，用4℃冷藏的PBS（pH7.4）將其稀釋為每20 μL 含4 個半數(shù)致死量（LD50）的稀釋液。各組小鼠腹腔注射濃度為1%的戊巴比妥鈉進行麻醉后，以4 LD50流感病毒液滴鼻感染，每只20 μL。感染24 h后灌胃（i.g）給藥，連續(xù)給藥3 d，病毒感染對照組以等體積生理鹽水灌胃。每日觀察小鼠生存狀態(tài)，連續(xù)觀察14 d，計算小鼠生存率和平均存活時間[5-8]。

1.3 小花清風藤水提物對流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)的影響

按照1.2 的方法對小鼠進行分組、造模和給藥，于造模后第5 d 對小鼠禁食8 h。將小鼠稱重并摘眼球放血后脫頸椎處死，取出全肺，用生理鹽水洗凈并用濾紙吸干后稱量肺重，計算肺指數(shù)。將左肺浸泡于0.5 mL RNAlater 液中保存于-20℃，右肺固定于0.5 mL福爾馬林中[7-9]。

1.4 小花清風藤水提物對流感病毒性肺炎小鼠肺勻漿病毒滴度和肺組織病理改變的影響

稱取1.3中RNAlater液浸泡的肺組織50 mg，置于含有0.5 mL TRIzol的EP管（2 mL，無RNase）中，將EP管置于勻漿機中研磨（60 Hz，60 s），TRIzol 法提取肺組織總RNA，用甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR熒光探針法）檢測肺勻漿病毒滴度。將1.3 中福爾馬林固定的小鼠右肺做常規(guī)固定、包埋、切片和HE染色后，顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理變化[10-12]。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小花清風藤水提物對流感病毒感染小鼠生存率、生存時間的影響

模型組小鼠生存率為10%，平均存活天數(shù)為8.4 d；小花清風藤水提物中劑量組生存率和平均存活天數(shù)明顯升高；磷酸奧司他韋組生存率和平均存活時間接近于正常組。結(jié)果見表1。

2.2 小花清風藤水提物對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響

由圖1A 可見，小花清風藤水提物高、低劑量組小鼠的肺指數(shù)低于模型組，但是與模型組比較沒有顯著性差異，提示小花清風藤水提物對流感病毒引起的小鼠肺部炎癥有一定的抑制作用。

2.3 小花清風藤水提物對流感病毒感染小鼠肺組織中病毒滴度的影響

由圖1B 可見，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中病毒滴度顯著增高，給藥后有所下降，但是與模型組比較沒有統(tǒng)計學差異。

2.4 小花清風藤水提物對流感病毒感染小鼠肺組織病理改變的影響

正常組小鼠肺組織肺泡大小一致，肺泡腔內(nèi)無分泌物，支氣管上皮完整，未見炎癥細胞浸潤，未見肺泡間質(zhì)炎癥；模型組小鼠肺組織大多數(shù)靜脈、支氣管旁出現(xiàn)大量炎細胞浸潤，炎細胞大于5層，肺組織間質(zhì)炎癥病變顯著，呈片狀分布，病變部位大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔顯著增厚，局部肺泡腔內(nèi)可見大量滲出物，肺泡腔明顯縮小，局部嚴重部位肺泡腔消失；磷酸奧司他韋組小鼠肺組織大多數(shù)靜脈、支氣管旁出現(xiàn)明顯炎細胞浸潤，但炎細胞較模型組少，局部支氣管（及細支氣管）旁肺組織間質(zhì)散在炎癥細胞浸潤，肺泡間隔輕度增生，間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)相對正常，炎癥累及范圍較為有限，僅累及個別支氣管（及細支氣管）周圍肺間質(zhì)組織；小花清風藤水提物中劑量組偶見靜脈、支氣管旁袖口裝炎癥浸潤，大多數(shù)靜脈、支氣管旁炎細胞浸潤明顯，炎細胞1～5 層，局部支氣管（及細支氣管）旁肺組織間質(zhì)散在炎癥細胞浸潤，肺泡間隔輕度增生，間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)相對正常，炎癥累及范圍較為有限，僅累及個別支氣管（及細支氣管）周圍肺間質(zhì)組織。見圖2。

表1 小花清風藤對流感病毒性肺炎小鼠生存率、生存時間的影響（n=10）

圖1 小花清風藤水提物對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)（A）和肺組織中病毒滴度（B）的影響

圖3 小花清風藤水提物對流感病毒感染小鼠肺組織病理改變的影響

3 討論

流感是由流感病毒引起的一種急性病毒性呼吸道傳染病，嚴重危害人類生命和健康。流感具有傳染性高、傳播迅速、周期性暴發(fā)和流行的特點。根據(jù)流感病毒核蛋白和基質(zhì)蛋白的抗原性差異，可將流感病毒分為A、B、C 三種類型，又將A 型流感病毒按照血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸苷酶（NA）的抗原性差異分成不同的亞型?？乖儺愂橇鞲胁《咀铒@著的生物學特征，這就使得治療流感病毒的藥物和疫苗很難發(fā)揮最佳治療和預(yù)防效果，所以研究抗流感病毒藥物具有重要意義。目前臨床應(yīng)用的抗流感病毒藥物有金剛烷胺、甲基金剛烷胺、病毒唑等，但這些藥物出現(xiàn)了耐藥性和毒性等問題，而中藥在這兩方面具有一定的優(yōu)勢和發(fā)展前景[13]。

本研究結(jié)果表明，小花清風藤水提物（i.g，6.5 g/kg）能提高小鼠生存率30%，并延長小鼠存活時間，降低小鼠肺指數(shù)和肺勻漿中病毒滴度，明顯改善感染小鼠肺組織炎癥病變。這些實驗結(jié)果提示小花清風藤水提物在體內(nèi)具有一定的抗流感病毒的作用。

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