LC-MS/MS測定荷瘤裸鼠血漿中和厚樸酚脂質(zhì)體濃度及其藥代動力學(xué)研究

丁士雯 ，馬紅霞，李嫻，劉運龍，陳知航，單成啟，程遠國，陳俐娟

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.四川大學(xué) 生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041

厚樸是中國傳統(tǒng)中藥材，其主要有效成分為厚樸酚、和厚樸酚[1]。現(xiàn)已證明，和厚樸酚具有抑制脂質(zhì)過氧化[2]、保護脊髓損傷神經(jīng)[3]、抑制多種細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡[4-6]、逆轉(zhuǎn)鼻咽癌多藥耐藥性[7]等藥理作用，是一種具有開發(fā)潛力的抗癌小分子。但由于和厚樸酚結(jié)構(gòu)中含有酚羥基[8]，易氧化，且水溶性較差，大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。脂質(zhì)體作為藥物的一種遞送系統(tǒng)，很好地克服了這一缺點，由于脂質(zhì)體與細胞膜結(jié)構(gòu)相似，使其更容易入胞。腫瘤部位具有增強滲透與滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)的特性，對脂質(zhì)體表面進行修飾，可使其具有被動或主動靶向性，減少副作用的發(fā)生[9-10]。目前，有關(guān)和厚樸酚脂質(zhì)體的藥效學(xué)已有報道，其可用于治療淋巴癌，聯(lián)合阿霉素抑制4T1細胞的增殖等[11]，但是對其進行藥代動力學(xué)的研究報道不多。

我們建立了快速、靈敏、簡便的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）方法，可檢測荷瘤裸鼠血漿中不同時間點和厚樸酚的含量，并對其進行了藥代動力學(xué)分析，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

荷瘤裸鼠（16～22 g，由四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室提供）；和厚樸酚（中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所，純度99.8%，批號：110730-201112）；大黃酚（作為內(nèi)標(biāo)）（中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所，純度99.5%，批號：110796-201118）；注射用和厚樸酚脂質(zhì)體凍干粉（成都金瑞基業(yè)生物技術(shù)有限公司，批號：2014502，20 mg/瓶）。

API-4000Q Trap 型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosysytem Sciex 公司）；Agilent1200 高效液相色譜儀（Agilent Technologies 公司）；YMC C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱（YMC 公司）；GL-88B型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-14G 高速離心機（上海醫(yī)療器械（集團）有限公司手術(shù)器械廠）；比朗超聲波清洗器（上海比朗儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司，批號：135525）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司，批號：134191）；乙酸乙酯（色譜純，Honeywell International Inc 公司，批號：C0033）；氨水（分析純，北京化工廠，批號：20090616）；純凈水（娃哈哈公司）。

1.2 溶液配制

精密稱取和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品10.02 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至10 mL容量瓶中，混勻得1 mg/mL的和厚樸酚儲備液，并用甲醇稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液供分析用。

精密稱取大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至10 mL容量瓶中，混勻得1 mg/mL的大黃酚儲備液，備用。

1.3 分析條件

1.3.1 液相條件 YMC C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相B 為0.025%氨水乙腈，A 為0.025%氨水，在線脫氣，流速0.8 mL/min。梯度洗脫：0～2 min，B 相85%～85%；2～4 min，B 相85%～10%；4～6 min，B 相10%～85%；6～8 min，B 相85%～85%，柱溫400C。進樣量10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源電噴霧電離源（ESI），負離子電離模式，霧化氣50 psi，加熱輔助氣50 psi，源溫度為600℃，毛細管電壓-4000 V，掃描方式多級反應(yīng)監(jiān)測（MRM），監(jiān)測離子對m/z 和厚樸酚（265.0→223.0）和內(nèi)標(biāo)（253.0→225.0），和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)碰撞能量分別為-41和-39 V。

1.4 樣品處理

取荷瘤裸鼠血漿樣品45 μL置于1.5 mL Ep管中，加入5 μL甲醇、5 μL內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg/mL），渦旋混勻，加100 μL 乙腈，渦旋2 min，14 000 r/min 離心10 min，破壞和厚樸酚脂質(zhì)體，裂解出未游離和厚樸酚。取上清液，進樣測定。

1.5 受試動物給藥方案

荷瘤裸鼠63 只隨機分為9 組，每組雌雄各半。瘤體積約為110 mm3時，尾靜脈注射20 mg/kg 和厚樸酚脂質(zhì)體，分別于2、5、15 min及0.5、0.75、1、2、4、6 h摘除眼球取血，肝素抗凝，5000 r/min離心5 min分離血漿，分裝后-80℃凍存，備測藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜分析

采用負離子方式檢測，將和厚樸酚和大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液按上述步驟操作，在一級全掃描質(zhì)譜圖中獲得和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)分子離子峰，選擇相應(yīng)準(zhǔn)分子離子峰進行碰撞誘導(dǎo)電離，生成碎片離子峰，兩者質(zhì)譜圖見圖1、2。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 方法專屬性 取濃度為0.500 ng/mL 的和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進樣，得和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（圖3A）；取空白血漿45 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按前述樣品處理操作，得空白血漿色譜圖（圖3B）；取0.500 ng/mL 的和厚樸酚血漿樣品，按前述樣品處理操作，得和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)提取后色譜圖（圖3C）；取荷瘤裸鼠靜脈注射單劑量單次給藥組1 號（給藥后0.75 h 樣品），按前述樣品處理操作，得血漿樣品中和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)色譜圖（圖3D）。結(jié)果顯示，在本實驗條件下，和厚樸酚和內(nèi)標(biāo)保留時間分別為2.9和5.1 min，峰形及分離度良好，血漿中雜質(zhì)不干擾樣品的測定，方法專屬性良好。

2.2.2 線性關(guān)系及定量下限 取荷瘤裸鼠空白血漿45 μL，分別加入和厚樸酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL，配制成血漿中含和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為0.500、2.000、5.000、25.00、100.0、250.0、500.0、1000 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，其余加入1 μg/mL 內(nèi)標(biāo)溶液同樣品處理方法，進樣測定。以待測物和厚樸酚濃度為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得方程y=0.0147x+0.000711（r2=0.9965）。表明和厚樸酚在0.500～1000 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.500 ng/mL（S/N＞10）。

2.2.3 回收率 按前述樣品處理方法，制備含和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為1.000、50.00、800.0 ng/mL的含藥血漿，進樣測定，得提取后色譜峰面積At；以水代替空白血漿配成含和厚樸酚1.000、50.00、800.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同上處理，得提取后色譜峰面積A0。每個濃度平行4份樣品。以At/A0×100計算得血漿樣品處理方法的絕對回收率，結(jié)果見表1。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿45 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按樣品處理方法操作，取上清液，將和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為1.000、50.00、800.0 ng/mL的溶液，進樣測定，記錄峰面積為At；用流動相將和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為1.000、50.00、800.0 ng/mL 的溶液，進樣測定，記錄峰面積為A0。每個濃度平行4 份樣品。以At/A0×100 評價方法基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表1。

表1 LC-MS/MS測定和厚樸酚及內(nèi)標(biāo)的絕對回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=4，）

表1 LC-MS/MS測定和厚樸酚及內(nèi)標(biāo)的絕對回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=4，）

圖1 和厚樸酚及內(nèi)標(biāo)的一級全掃描質(zhì)譜圖

圖2 和厚樸酚及內(nèi)標(biāo)的產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜圖

圖3 測定和厚樸酚特異性色譜圖

2.2.5 稀釋效應(yīng) 用空白血漿配成1000 ng/mL 的含藥質(zhì)控樣品，用空白血漿稀釋成濃度為200.0、100.0、50.00 ng/mL 的含藥樣品，每個濃度平行4 份樣品，其余按樣品處理方法操作進樣測定，以測得值與理論值的比值考察稀釋效應(yīng)。結(jié)果顯示，稀釋后其與理論值比值為85.80%～113.86%，無稀釋效應(yīng)。

2.2.6 精密度與準(zhǔn)確度 以空白血漿配制1.000、50.00、800.0 ng/mL 的血漿樣品，按樣品處理方法提取后進樣分析，每個濃度平行測定6份樣品，此為一個分析批。測定3 個分析批，分別用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得濃度。計算批內(nèi)和批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評價方法的精密度及準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗 配制1.000、50.00、800.0 ng/mL的含藥血漿，分別進行室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性及長期穩(wěn)定性實驗，每個樣品平行4份，結(jié)果見表3。

2.2.8 藥代動力學(xué)研究 測得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007 軟件處理，計算和厚樸酚藥代動力學(xué)參數(shù)。用Microcal Origin 7.0軟件做平均血藥濃度-時間曲線（圖4）。

表4為荷瘤裸鼠單次靜脈注射和厚樸酚脂質(zhì)體后和厚樸酚藥代動力學(xué)參數(shù)。單次靜脈注射和厚樸酚脂質(zhì)體后，和厚樸酚消除相對半衰期T1/2為49.1±6.1 min，AUC（0～360 min）為173073±49503.3 ng/（min·mL），峰濃度Cmax為12915±4022.5 ng/min，平均滯留時間（MRT）為21.1±3.5 min，表明和厚樸酚脂質(zhì)體在體內(nèi)釋放速率較快。

3 討論

研究表明，和厚樸酚能以時間及劑量依賴性方式誘導(dǎo)肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞的凋亡，在有效的治療濃度下正常細胞具有良好的耐受性，因而在治療腫瘤方面有良好的開發(fā)潛力[12]。脂質(zhì)體攜帶藥物具有靶向性強、毒副作用小、運載量大等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于腫瘤導(dǎo)向治療。Cheng[13-14]等在組織分布及體內(nèi)小鼠移植瘤模型上均證明修飾的和厚樸酚脂質(zhì)體明顯優(yōu)于普通和厚樸酚靜脈制劑。

表2 LC-MS/MS測定和厚樸酚的精密度和準(zhǔn)確度（n=6，）

表2 LC-MS/MS測定和厚樸酚的精密度和準(zhǔn)確度（n=6，）

對于和厚樸酚的檢測，常用GC 法[15]、HPLCDAD 法[16]、RP-HPLC 法等。本實驗采用LC-MS/MS法，能將質(zhì)譜的高分辨率、高靈敏度與液相色譜的高分離能力統(tǒng)一起來，提高了靈敏度與檢測限。本實驗中和厚樸酚及大黃酚在色譜柱中得到很好的分離，且在8 min 內(nèi)運行完畢，分析速度快，具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度、樣品前處理簡單方便的特點，且對樣品的需求量少，為臨床對和厚樸酚的大樣本量藥代動力學(xué)研究提供了方法學(xué)參考。

由于和厚樸酚與內(nèi)標(biāo)大黃酚結(jié)構(gòu)中酚羥基的存在[17]，其在水溶液中會解離，形成負離子形式，故在檢測時采用負離子模式。在進行流動性的優(yōu)化過程中，使用乙腈與水進行梯度洗脫時，發(fā)現(xiàn)峰形拖尾較為嚴重，由于受試品呈弱酸性，故用甲酸調(diào)節(jié)酸性對其進行峰形優(yōu)化，加入不同濃度的甲酸，發(fā)現(xiàn)峰形有所改變，但響應(yīng)值大大減小，甲酸壓低了負離子相應(yīng)信號。一般液質(zhì)流動性pH值為pKa+2[18]，受試品pH值在6 左右，因此，向乙腈中加入適量氨水調(diào)節(jié)pH值，通過對乙腈中氨水含量及水溶液中氨水含量的不斷調(diào)整，最終確定0.025%氨水乙腈∶0.025%氨水為流動相。

圖4 荷瘤裸鼠靜脈注射和厚樸酚脂質(zhì)體后的平均血藥濃度-時間曲線（n=6，）

表3 LC-MS/MS測定和厚樸酚的穩(wěn)定性（n=4，）

表3 LC-MS/MS測定和厚樸酚的穩(wěn)定性（n=4，）

表4 6組荷瘤裸鼠尾靜脈注射20 mg/kg和厚樸酚脂質(zhì)體后主要藥代動力學(xué)參數(shù)（n=6）

本實驗的方法學(xué)驗證滿足了國家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于生物樣品分析方法學(xué)驗證的要求。荷瘤裸鼠尾靜脈注射20 mg/kg 和厚樸酚脂質(zhì)體后，血漿中和厚樸酚消除相對半衰期和平均滯留時間較短，表明其在體內(nèi)釋藥速率較快。血漿中游離和厚樸酚濃度變化還須進一步研究，以期更好地闡明和厚樸酚脂質(zhì)體的藥代動力學(xué)特點。

綜上，通過優(yōu)化條件，本實驗中樣品采用直接沉淀法，操作簡單，血漿樣品用量僅需45 μL，定量下限為0.500 ng/mL（n=5），分析每個樣品僅需8 min，而且該法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，適合和厚樸酚脂質(zhì)體藥代動力學(xué)研究和血藥濃度監(jiān)測。

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