Micro-CT 評價Runx2 基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植促進缺血性股骨頭壞死兔壞死股骨頭修復(fù)效果

許海甲，李章華，侯煜東，方衛(wèi)軍，唐歡

武漢大學(xué) 人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060

缺血性股骨頭壞死（ascular necrosis of femoral head，ANFH）是臨床上的常見多發(fā)病，主要見于中青年患者，其致殘率高，遠期預(yù)后較差[1]。目前臨床上有多種治療ANFH的方法，包括物理治療、髓芯減壓、旋轉(zhuǎn)截骨、帶或不帶血管蒂的骨移植、介入治療等[2]，但上述方法的治療效果有限，最終難以避免股骨頭塌陷，須行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。近年來骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植治療ANFH的研究被廣泛開展，甚至用于臨床治療，取得了一定的治療效果[3]，然而在評價股骨頭壞死后病灶改變及治療修復(fù)程度上缺少成熟有效的方法，普通CT、MRI 檢測僅能觀察較大范圍的骨形態(tài)及骨性質(zhì)改變，常用的Harris 評分和目測類比評分等方法容易受主觀因素影響且無法用于實驗動物。Micro-CT作為一種新的影像學(xué)檢測技術(shù)，分辨率可達微米級，能清晰顯示出骨骼中骨小梁等微觀結(jié)構(gòu)，對ANFH標(biāo)本骨小梁等微結(jié)構(gòu)變化具有極高的敏感性[4]。在本研究中，我們通過Micro-CT 來評價Runx2基因修飾MSCs 靜脈移植促進ANFH 的修復(fù)效果，為應(yīng)用Micro-CT觀察股骨頭壞死修復(fù)過程提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性大耳白兔24只，體重（1.5±0.25）kg，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供（SCXK（京）2007-0003），單籠飼養(yǎng)，自由飲水。24 只大耳白兔ANFH造模后隨機分為4 組，A 組為AdEasy/Runx2修飾的MSCs靜脈植入組，B組為Runx2siRNA修飾的MSCs靜脈植入組，C組為單純MSCs靜脈植入組，D組為生理鹽水植入組。

兔MSCs 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供；AdEasy/Runx2由前期實驗構(gòu)建成功[5]；Western印跡檢測用anti-Cbfa1多克隆抗體（LifeSpan BioSciences 公司），anti-GAPDH 多克隆抗體、羊抗兔二抗（康為世紀(jì)公司）；Real-time PCR 檢測試劑盒（Kapa 公司）；TRIzol 裂解液（Sigma公司）；蛋白抽提試劑（Fermentas 公司）；低糖型DMEM 培養(yǎng)基（L-DMEM）、胎牛血清（Gibico 公司）；青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胰蛋白酶（Amresco 公司）；烏拉坦（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；兔Runx2反義核苷酸siRNA（上海吉瑪公司，正義鏈5'-CACGCUAUUAAAUCCAAAUTT-3'，反義鏈5'-AUUUGGAUUUAAUAGCGUGTT-3'）；PCR 引 物（北京生工公司）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司）；超凈工作臺（北京長城公司）；臺式高速離心機（Eppebdorf 公司）；實時熒光定量PCR 儀（Stratagene 公司）；免疫酶聯(lián)儀（Lab System公司）；蛋白電泳儀（BioRad公司）；紫外分光光度計（Pharmacia公司）；Micro-CT（Siemens公司）。

1.2 兔ANFH模型的建立

參考崔西龍等[6]的方法建立ANFH模型。用5%烏拉坦按1 mg/kg 的劑量行腹腔注射麻醉，先取俯臥位髖部外側(cè)切口，以大轉(zhuǎn)子處為中心切開皮膚約4 cm，分離臀部肌肉，顯露髖關(guān)節(jié)，切開關(guān)節(jié)囊，用液氮冷凍至股骨頭表面關(guān)節(jié)軟骨呈石膏色，冷凍結(jié)束后立即用37℃的生理鹽水將股骨頭復(fù)溫3 min，逐層縫合傷口，縫合皮下組織及皮膚。再取仰臥位，沿腹股溝做切口約2 cm，顯露旋股內(nèi)外側(cè)動脈，分離并結(jié)扎旋股內(nèi)外側(cè)動脈，縫合傷口。術(shù)后每天用碘酒消毒手術(shù)切口2 次，注射青霉素40 萬U/d，連續(xù)5 d。

1.3 MSCs體外Runx2基因修飾

取MSCs于25 mL細胞培養(yǎng)瓶中傳代擴增，至一定數(shù)量后，將細胞分為3 組：①轉(zhuǎn)染AdEasy/Runx2組；②轉(zhuǎn)染Runx2siRNA組；③單純細胞組。待細胞生長融合至70%～80%時，棄培養(yǎng)液，換為無血清LDMEM 培養(yǎng)液，第①組細胞轉(zhuǎn)入6×106IU AdEasy/Runx2，第②組細胞轉(zhuǎn)入250 pmolRunx2siRNA，第③組細胞不做處理，所有細胞在5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)24 h后換完全培養(yǎng)液。

1.4 Western 印跡檢測基因修飾后Runx2 蛋白的表達水平

收集細胞于EP管，用80 μL蛋白提取液提取約1×106細胞總蛋白，冰浴裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清用BCA法定量蛋白，加蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，取40 μg 蛋白行蛋白電泳，濃縮膠80 V 電壓、分離膠120 V 電壓，100 V 電壓60 min 電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF 膜，用5%脫脂奶封閉60 min，加一抗1∶1000 稀釋后孵育60 min，用TBST 洗膜5 min×3 次，加二抗1∶8000 稀釋后孵育60 min，用TBST洗膜5 min×3次，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.5 Real-time PCR 檢測基因修飾后Runx2 mRNA的表達水平

收集細胞于EP 管，約1×106個細胞加1 mL TRIzol 裂解液，按Sigma 公司提供的說明書提取總RNA，紫外分光光度計定量RNA，取1 μg總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按PCR 試劑盒說明書進行實驗。GAPDH 上游引物為5'-TGGAATCCACTGGCGTCTT C-3'，下游引物為5'-GGTTCACGCCCATCACAAAC-3'；Runx2上游引物為5'-GACTGTGGTTACCGTCAT GGC-3'，下游引物為5'-ACTTGGTTTTTCATAACA GCGGA-3'。反應(yīng)體系：2×Kapa SYBR Fast qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各400 nmol/L，cDNA 約50 ng，加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)。

1.6 MSCs收集及靜脈注射

兔ANFH 造模4 周后，收集體外Runx2修飾的MSCs，計數(shù)后用生理鹽水將細胞終濃度調(diào)至5×106/mL。于耳緣靜脈注射細胞懸液，A組每只兔注入1×107個AdEasy/Runx2轉(zhuǎn)染的MSCs，B 組兔注入1×107個Runx2siRNA 轉(zhuǎn)染的MSCs，C 組兔注入1×107個未處理組MSCs，D 組作為對照組，注入等體積生理鹽水。

1.7 股骨頭標(biāo)本采集及Micro-CT掃描

細胞植入后分別于2、4、6、8周后取出各組股骨頭標(biāo)本，浸泡在福爾馬林液里密封保存。于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所完成Micro-CT 掃描，掃描部位取家兔股骨標(biāo)本近端股骨頸以上至股骨頭末端，保持股骨長軸與掃描室切面垂直，設(shè)定掃描參數(shù)為掃描層面厚度20 μm、球管電壓80 kV、電流500 μA。掃描完成后，選取股骨頭區(qū)域進行分析、比較。觀察比較各組兔股骨頭形態(tài)、關(guān)節(jié)面有無變形塌陷，軟骨下骨密度、骨小梁分布及形態(tài)等。

2 結(jié)果

2.1 AdEasy1/Runx2轉(zhuǎn)染MSCs的效率及鑒定

AdEasy 載體攜帶GFP 標(biāo)簽，AdEasy1/Runx2轉(zhuǎn)染MSCs 培養(yǎng)約48 h 后，熒光顯微鏡下可見細胞發(fā)出綠色熒光，當(dāng)MOI 為80 時，約80%的細胞可發(fā)熒光，AdEasy1/Runx2可有效感染MSCs（圖1）。一般情況下MSCs 表達的Runx2水平很低，但AdEasy1/Runx2轉(zhuǎn)染后MSCs 中Runx2mRNA 的表達水平明顯提高（圖2），蛋白水平也顯示Runx2的表達顯著增加（圖3），說明轉(zhuǎn)入的外源性Runx2極大地增強了MSCs表達Runx2mRNA及Runx2蛋白的能力。

2.2 Runx2 siRNA轉(zhuǎn)染MSCs效果鑒定

圖1 MSCs形態(tài)觀察

圖2 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染AdEasy1/Runx2后Runx2 mRNA表達

Runx2反義核苷酸序列siRNA 轉(zhuǎn)染MSCs 后，對MSCs 的生長及形態(tài)無明顯影響。以不加siRNA 細胞為對照組，含50 nmol/L siRNA 的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h 后可明顯降低Runx2的mRNA 表達水平（圖4），Runx2蛋白表達水平也明顯被抑制（圖5）。

2.3 Micro-CT掃描結(jié)果

第2周Micro-CT掃描結(jié)果顯示各組股骨頭均有壞死，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)面邊緣模糊，軟骨面骨皮質(zhì)厚度變薄，關(guān)節(jié)面下骨密度分布不均勻，軟骨下出現(xiàn)囊性樣改變，骨小梁稀疏、出現(xiàn)斷裂不連續(xù)、結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁間隙變寬，但各組間差異不明顯。至第4周，A、B、C組骨壞死程度不再加劇，并出現(xiàn)輕度修復(fù)反應(yīng)；而D組無改善，骨小梁進一步減少，骨小梁間隙進一步增加，皮質(zhì)骨下部分區(qū)域出現(xiàn)骨缺損形成小空洞。第6周，A、B、C組出現(xiàn)更為明顯的修復(fù)反應(yīng)，骨皮質(zhì)厚度增加，骨小梁數(shù)目及厚度增大，其中以A組表現(xiàn)較為明顯，B 組相對較差；而D 組骨質(zhì)進一步減少，骨皮質(zhì)邊緣不光滑，甚至有塌陷，皮質(zhì)骨下空洞較之前更為擴大，骨小梁數(shù)目嚴(yán)重減少。至第8 周時各組表現(xiàn)出顯著差異，A組股骨頭關(guān)節(jié)面清晰、形態(tài)完整，軟骨下骨質(zhì)密度均勻，骨小梁致密，股骨頭形態(tài)基本接近正常；B組股骨頭形態(tài)較A組差，但較其第2 周時有明顯改善；C 組修復(fù)情況介于兩者之間；D組股骨頭壞死嚴(yán)重，關(guān)節(jié)面有塌陷，關(guān)節(jié)面下出現(xiàn)較大骨缺損空洞，骨小梁變薄變稀疏，骨密度也嚴(yán)重下降（圖6）。圖7 為A、D 組股骨頭在各時間點的Micro-CT掃描比較。

圖3 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染AdEasy1/Runx2后Runx2蛋白的表達

圖4 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染Runx2 siRNA后Runx2 mRNA的表達

圖5 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染Runx2 siRNA后Runx2蛋白的表達

3 討論

圖6 8周時股骨頭Micro-CT檢測結(jié)果

ANFH主要的骨形態(tài)改變表現(xiàn)為骨質(zhì)連續(xù)性破壞和骨小梁形態(tài)異常，股骨頭壞死的生物應(yīng)力可改變骨小梁的立體結(jié)構(gòu)及空間排列，使其力學(xué)強度減弱，最終難以承重導(dǎo)致塌陷[7]。ANFH 發(fā)生后，成骨細胞介導(dǎo)的新生骨生長和破骨細胞介導(dǎo)的壞死骨吸收同時出現(xiàn)[8]。隨著兩種作用的進展，骨內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)尤其是骨小梁形態(tài)會發(fā)生不斷改變。檢測和觀察股骨頭壞死病灶局部微觀結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的過程，是判斷病程進展、評價修復(fù)程度的重要方法，過去因缺少有效檢測方法而難以評價。隨著影像學(xué)檢測技術(shù)的進步，應(yīng)用Micro-CT 可對在體及離體骨組織微觀結(jié)構(gòu)進行高清成像，其分辨率可達微米級別，而不破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)合相關(guān)分析軟件可以對骨小梁相關(guān)參數(shù)和骨密度等指標(biāo)進行定量分析[9]，此外結(jié)合血管灌注造影技術(shù)還可對股骨頭血供進行立體觀察[10]，這提供了一種通過微觀結(jié)構(gòu)定性定量精確評價股骨頭的有效方法。

MSCs 移植治療ANFH 已被大量運用于科研實驗及臨床治療之中，常見的方法包括髓芯鉆孔減壓聯(lián)合MSCs 注射移植、介入加MSCs 移植、基因轉(zhuǎn)染MSCs 靜脈移植等，均有一定的治療效果[11]。Runx2是一種成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，體內(nèi)外研究均表明Runx2過表達可增強MSCs的成骨分化能力，促進修復(fù)骨缺損及骨壞死[12]。而將Runx2基因轉(zhuǎn)染MSCs后靜脈移植治療ANFH，觀察其修復(fù)股骨頭壞死、預(yù)防股骨頭塌陷的相關(guān)研究尚未見報道。

本研究對各處理組兔細胞移植后2、4、6、8周不同時段取股骨頭標(biāo)本行Micro-CT 檢測，觀察股骨頭修復(fù)過程中微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及計量學(xué)參數(shù)對比，不僅可以比較組間修復(fù)差異，還能動態(tài)評價病灶修復(fù)進程。Micro-CT 檢測結(jié)果顯示MSCs 移植治療組自第2周開始股骨頭微觀結(jié)構(gòu)逐漸改善，至第8周時取得了較好的修復(fù)效果，股骨頭形態(tài)完整，但又以Runx2修飾組修復(fù)效果最明顯，Runx2抑制組修復(fù)效果相對較差。對照組自第2周起股骨頭微觀結(jié)構(gòu)逐漸破壞，至8 周后骨小梁形態(tài)嚴(yán)重異常，股骨頭塌陷，這可能與其力學(xué)強度喪失有關(guān)[7]。本研究肯定了MSCs 移植治療兔ANFH 的效果，且證明Runx2基因修飾后能進一步提升MSCs移植后的治療效果。

本實驗雖然在腺病毒介導(dǎo)的Runx2轉(zhuǎn)染MSCs移植治療組取得了最佳療效，但腺病毒載體的生物安全性還有待進一步檢測[13]。MSCs 可大量歸巢至骨壞死病灶，也有部分能歸巢至其他部位[14]，Runx2的高表達可能促成異位成骨或其他異常情況。實驗中僅僅檢測了短期修復(fù)效果，遠期療效有待評估。此外，我們選取兔作為造模對象，其主要靠后肢承重，但仍為四足動物，這與人的生理結(jié)構(gòu)和承重機制仍有一定差異。總之，Runx2修飾MSCs后靜脈移植可作為ANFH 的一種新的治療方法，但將此方法應(yīng)用于人體的安全因素及治療效果仍須繼續(xù)探索。

[1]Gagala J,Buraczynska M,Mazurkiewicz T,et al.Prevalence of genetic risk factors related with thrombuphilia and hypofibrinolysis in patients with osteonecrosis of the femoral head in Poland[J].BMC Muscuioskelet Disard,2013,14:264.

[2]Yan Z,Huang D,Guo C,et al.Fate of mesenchymal stem cells transplanted to osteonecrosis of femoral head[J].J Orthop Res,2009,27(4):442-446.

[3]Xie X H,Wang X L,He Y X,et al.Promotion of bone repair by implantation of cryopreserved bone marrow-derived mononuclear cells in a rabbit model of steroid-associated osteonecrosis[J].Arthritis Rheum,2012,64(5):1562-1571.

[4]Hambli R.Micro-CT finite element model and experimental validation of trabecular bone damage and fracture[J].Bone,2013,56(2):363-374.

[5]李章華,趙強,唐歡,等.成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定[J].生物技術(shù)通訊,2014,25(4):511-514.

[6]崔西龍,李章華,戴雙武,等.改良型非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死動物模型的建立[J].武漢大學(xué)學(xué)報,2012,31(1):61-64,110.

[7]Sakai T,Sugano N,Nishii T,et al.Extent of osteonecrosis on MRI predicts humeral head collapse[J].Clin Orthop Relat Res,2008,466(5):1074-1080.

[8]王程,茍文隆,徐小龍,等.人股骨頭壞死標(biāo)本不同區(qū)域骨小梁的顯微結(jié)構(gòu)特征及病理學(xué)表現(xiàn)[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,35(5):463-465.

[9]Effendy N M,Khamis M F,Shuid A N.Micro-CT assessments of potential anti-osteoporotic agents[J].Curr Drug Targets,2013,14(13):1542-1551.

[10]謝巍,周小兵,李靚,等.股骨頭血供的三維可視化建模及意義[J].解剖學(xué)雜志,2010,33(1):124-125.

[11]李瑞琦,張國平,任立中,等.骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死的評價[J].中國組織工程研究,2013,17(35):6327-6332.

[12]Zheng H,Guo Z,Ma Q,et al.Cbfa1/osf2 transduced bone marrow stromal cells facilitate bone formation in vitro and in vivo[J].Calcif Tissue Int,2004,74(2):194-203.

[13]Pathak A,Patnaik S,Gupta K C.Recent trends in non-viral vector-mediated gene delivery[J].Biotechnol J,2009,4(11):1559-1572.

[14]Li Z H,Liao W,Cui X L,et al.Intravenous transplantation of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells and its directional migration to the necrotic femoral head[J].Int J Med Sci,2011,8(1):74-83.