賀國麗，蔡俊宏

(海南省人民醫(yī)院，?？?570311)

人乳頭瘤病毒(HPV)是宮頸病變與宮頸癌的主要病因，已知與宮頸癌相關(guān)的高危型HPV型別有14種，研究報道認為宮頸的HPV感染率和感染型別存在著地區(qū)差異。本文通過對14 335份宮頸細胞刷片標本的14種高危HPV亞型檢測，初步了解本地區(qū)女性高危HPV感染率以及所感染高危亞型的分布情況，為本地區(qū)癌前病變和宮頸癌的篩查以及預(yù)防性和治療性疫苗的應(yīng)用提供資料和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2009～2012年我院婦科門診就診或體檢者的宮頸刷片標本共14 335份，患者年齡17～78歲，平均(36．85 ±9．69)歲。

1.2 試劑與儀器

凱普HPVDNA提取試劑盒、DNA擴增試劑盒和HPV核酸分型檢測試劑盒(潮州凱普生物化學(xué)有限公司)、PCR擴增儀、Hybrmiax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀。

1.3 標本采集

擴陰器暴露宮頸口后，用特制宮頸刷順時針轉(zhuǎn)5圈以上，將刷頭折斷放入已加有專用細胞保存液的取樣管中，立即送檢或4℃保存在48小時內(nèi)檢測。

1.4 分型檢測

1.4.1 DNA模板的制備 樣本制備過程按凱普公司的HPVDNA提取試劑盒使用說明進行。將樣品管渦旋振蕩混勻，取500μl宮頸細胞保存液，14 000 r/min離心5min，沉淀加400μl溶液Ⅰ于100℃水浴15min，再加入 400μl溶液Ⅱ，14 000r/min 離心5min，棄去上清，獲取核酸沉淀，用60μl溶液Ⅲ溶解核酸沉淀后備用。

1.4.2 PCR擴增 使用凱普DNA擴增試劑盒擴增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒說明書。每管23．25μl PCRmix和0．75μl Taq 酶配制擴增反應(yīng)液，各加已提取的DNA樣本模板1μl進行擴增。PCR反應(yīng)條件為 95℃ 預(yù)變性 9min，95℃20s，55℃30s，72℃30s，共40 個循環(huán)，72℃延伸5min。

1.4.3 雜交并顯色 按照Hybrmiax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀操作步驟進行雜交試驗并顯色。

1.4.4 結(jié)果判讀 檢測結(jié)果陽性為肉眼清晰可見的紫藍色圓點，根據(jù)試劑盒提供的膜條HPV分型分布圖判讀結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計方法

用Excel建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計，χ2檢驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 高危HPV各亞型感染率

在14 335例標本中，高危HPV陽性4 496例，陽性率為31．36%。位居前三位的高危亞型為52、16、58，感染率分別為 22．75%、20．82%、15．01%，其 余 依 次 是 18(7．59%)、33(6．49%)、68(5．75%)、31(5．18%)、39(3．49%)、56(3．12%)、66(2．67%)、59(2．56%)、35 和 51 分別(1．75%)、45(1．07%)。因低危HPV陽性僅80例且型別分散，未納入統(tǒng)計分析。

在HPV陽性者中，單一亞型感染者3 804例，占84．61%;2種亞型混合感染者 531例，占11．81%;3種亞型混合感染106例，占2．36%;4種亞型混合感染35例，占0．78%;5種亞型混合感染18例，占 0．40%;7種亞型混合感染 2例，占0．05%。各亞型感染情況見表1。

表1 14種高危HPV亞型感染分布及感染率

2．2 各年齡段女性宮頸高危HPV檢出情況

在4 496例高危HPV陽性的受檢者中，以＜50歲居多為3 928例，占87．37%。在各年齡段中，＜30歲 1 238例，陽性率為 33．92%;31～40歲1 389例，陽性率 26．71%;41～50 歲1 301 例，陽性率30．60%;51～60歲398例，陽性率46．88%;＞60歲170例，陽性率44．39%。HPV感染率在＜30歲與31～40 歲(χ2=53．10，P ＜0．005)、31～40 歲與41～50 歲(χ2=16．39，P ＜0．005)、41～50 歲與 51～60 歲(χ2=84．28，P ＜0．005)年齡段之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在51～60歲與＞60歲年齡段的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0．62，P ＞0．25)。見表2。

表2 不同年齡段高危HPV感染情況

2.3 HPV多重感染情況

在HPV多重感染中，以二種亞型的混合感染多見，陽性率在 ＜30歲與 31～40歲(χ2=1．31，P ＞0．25)、31～40 歲與41～50 歲(χ2=0．27，P ＞0．5)、41～50歲與 ＞50 歲(χ2=1．68，P ＞0．25)之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。HPV三種亞型及以上的多重感染中，陽性率在 ＜30歲與31～40歲(χ2=38．69，P ＜ 0．005)、41～50 歲與 ＞ 50 歲(χ2=89．60，P＜0．005)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義;在31～40歲與41～50歲年齡段的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0．89，P ＞0．5)。見表3。

表3 多重HPV感染情況

3 討論

盡管HPV感染在女性人群中是非常普遍的，但是HPV的感染率有較大的地區(qū)性差異，報道的范圍為 1．4%～25．6%［1］。國外一項對多個地區(qū)的157 879名細胞學(xué)正常女性的檢測分析顯示，全球的HPV感染率為10．4%，其中非洲為22．1%，中美洲為20．4%，南美洲為12．3%，北美洲為11．3%，亞洲為8．0%，歐洲為8．1%［2］，分析認為形成這一差異的主要原因，應(yīng)該是各地區(qū)間經(jīng)濟發(fā)展不平衡所導(dǎo)致的生活水平和條件不同造成的［3-4］。目前尚無全國性的宮頸HPV感染情況的權(quán)威性結(jié)果，但已有不少省市區(qū)發(fā)表了各自的HPV感染情況報告，如深圳市為 24．5%、湖南長沙 44．45%、潮州地區(qū)8．25%、西安長安區(qū) 23．56%、廣西南寧 20．50%、重慶地區(qū)為37．3%、成都農(nóng)村地區(qū)為21．98%，黔北地區(qū)23．76%、浙南地區(qū) 28．98%、陜西咸陽 18．70%，浙江臺州地區(qū)對10 007例婦科門診患者檢測的HPV感染率為44．45%［3-11］。本文的門診感染者中以高危亞型感染為主，且高危型HPV陽性率達31．36%，屬于感染率比較高的地區(qū)，值得重視。因為這些受檢者系門診就診者，不是接受普查的人群，是否存在偏差還待下一步研究證實。

研究結(jié)果顯示，HPV亞型的分布與種族、年齡、地域等諸多因素有關(guān)聯(lián)。全世界范圍內(nèi)共同的最常見感染亞型是16型，18型位居第二，45型在非洲、歐洲、北美洲位居第三，31型在南美洲位居第三，52、58型在亞洲常見［12］。我國浙江臺州、深圳、黔北地區(qū)和湖南長沙、浙南地區(qū)報道的HPV高危亞型位居前三位的是 HPV16、52、58 和 16、58、52，南寧和潮州地區(qū)為52、16、58。本文位于前三位的亦分別為 52、16、58 亞型，分別占 22．75%、20．82%、15．01%，而西安報道的是 16、18、31，江蘇常州地區(qū)是16、58、39。中國南方地區(qū)52、58亞型的感染率似乎較北方高［7］，然而 HPV52、HPV58的感染率，是否在國內(nèi)的其它地區(qū)也遠超過HPVl8，還有待于相關(guān)的研究確定。造成這種優(yōu)勢亞型分布的差異可能與地理環(huán)境、社會生物因素或宿主的遺傳免疫因素有關(guān)［4，7］。

HPV單一亞型感染是主要的感染模式，占60%以上，高于多種亞型感染。本文中單一高危亞型感染占84．61%，多重感染占15．39%，其中二個亞型混合感染占11．81%、三個亞型感染占2．36%、四個亞型感染占0．78%、五個亞型感染占0．40%、七個亞型感染占0．04%。檢測結(jié)果表明HPV是以單一感染為主的，52、16、58、18、33、68、31 是本地區(qū)的常見亞型，而在多重感染中 16、58、52、18、33 仍然為最常見基因型，與國內(nèi)報道的大部分情況相似。

二種亞型的混合感染率，在各年齡段之間沒有差異。而三種及以上的多重感染率以＜30歲和＞50歲年齡段為高，可能是因為年輕女性的性生活活躍、存在流產(chǎn)、分娩事件的影響以及健康意識不強;而老年女性卵巢功能減退，免疫力下降，病毒清除能力減弱，健康意識弱化，導(dǎo)致這二個年齡段容易出現(xiàn)多型 HPV 的混合感染［4，6，8，11］。

預(yù)防和治療HPV感染的理想方法是疫苗接種，而研制和應(yīng)用HPV疫苗就需要了解各地區(qū)HPV型別的感染狀況、感染的優(yōu)勢型別。雖然目前認為HPV52、58、33亞型與宮頸癌的相關(guān)性低于HPV16、18，但它們在我國所呈現(xiàn)的高感染率和普遍性應(yīng)該予以足夠的重視［3，6，7，10，11］?，F(xiàn)在國際上使用的疫苗主要是二價疫苗(16/18)或四價疫苗(16/18/6/11)，并沒有包含我國高發(fā)的高危型52、58、33等，所以現(xiàn)有的HPV疫苗如要在我國推廣使用尚有待于改進增加型別。HPV58和52是我國包括子宮頸癌高發(fā)區(qū)婦女中位居第一、第二或第三種的型別，因此這些型別在亞洲(尤其是中國高發(fā)區(qū))人群中具有重要意義，包括58、52、33型的HPV疫苗才能為我國及相關(guān)國家婦女提供更高保護率。正如WHO專家提出，如果增加 HPV31，33，35，45，52 和 58 型，可以在預(yù)防世界70%的宮頸癌基礎(chǔ)上增加約20%對宮頸癌的預(yù)防能力［6］，因此應(yīng)用于我國的HPV疫苗應(yīng)該至少覆蓋16、58、52亞型。

本文通過HPV分型檢測方法對海南地區(qū)婦科門診就診者的高危型HPV感染情況進行了分析，結(jié)果顯示HPV以單一型感染為主;感染率是31．36%;位居前幾位亞型是 16、52、58、18、33、68、31 型;多重感染亞型可有七種之多;HPV感染與年齡有一定關(guān)系。明確HPV在特定地區(qū)及人群的感染率及型別分布差異，對HPV所致疾病的防治及宮頸癌疫苗研制應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

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