石油烴降解菌的分離及在含油污泥中的應用

姚力芬1 李 丹1 陳麗華2 李廣彬1 孫盼盼1 李佳釀3

（1．西北民族大學 化工學院，甘肅 蘭州，730030；2．西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州，730030；3．西北民族大學 電氣工程學院，甘肅 蘭州，730030）

近年來，石油污染的環(huán)境污染問題已越來越引起人們的廣泛關注，在治理石油污染的方法中，生物修復法因其獨特的優(yōu)勢受到廣泛關注[1]。篩選出高效降解石油烴降解菌是生物修復的必然，目前有關石油降解菌方面的研究報道較多[2-3]。本文從甘肅隴東長慶油田中取得含油污泥，從中分離篩選得到六株降解石油烴菌株，并將其制得混合菌劑，同時進行了混合菌劑處理含油污泥的小試實驗，為以后的實際應用奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 含油污泥

試驗所用油泥采自甘肅隴東油區(qū)。油泥的TPH含量為50g/kg，含水率為25%，pH為7.82。

2 實驗方法

2.1 菌株分離

根據(jù)雒曉芳[4]等人的分離方法，取土樣2.5g，加入到有200mL無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃，120r/min的恒溫搖床上進行振蕩培養(yǎng)7d，移取一定量的富集培養(yǎng)液接入新鮮降油培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)7d，相同操作共重復3次，經過3個周期的馴化后，在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在降油培養(yǎng)基的平板上劃線后，平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72h，然后將代表性較好的菌落在降油培養(yǎng)基平板上反復劃線純化得到單一菌落，再將純化的菌株接種至斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存于4℃冰箱中，待用。

2.2 菌株的鑒定

（1）常規(guī)鑒定：參照《微生物學實驗》[5]，對篩選得到的六株菌株進行了菌落特征及菌體形態(tài)特征觀察。

（2）生理生化鑒定：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]首先將篩選出來的六株菌進行復活，在無菌條件下，分別各挑取少量菌加入生化管中，密封，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察現(xiàn)象，平行做兩組實驗。

2.3 混合菌劑的發(fā)酵

2.3.1 菌劑的復活

將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制好后，分裝于試管中，每支試管約4-5mL，后將所有所需儀器高壓滅菌，滅菌條件：121℃，20min，50℃保存。隨后在超凈臺上進行接種，接種完后在恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，保存進行下一步工作。

2.3.2 一次擴培

將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制好后，分裝于三角瓶中，每個三角瓶約10mL，后將所有所需儀器高壓滅菌，滅菌條件：121℃，20min，50℃保存。隨后在超凈臺上進行接種，接種完后在恒溫搖床培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，保存進行下一步工作。

2.3.3 發(fā)酵

做好發(fā)酵罐的滅菌工作，然后進行接種，即倒入由a1、a2、a3、a4、a5、a6這六株菌（前三株所占體積百分數(shù)為50%，后三株為50%）按體積比為1:1:1:1:1:1配成菌懸液。

2.4 生長曲線的測定

按照文獻[5]，對于在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵的混合菌劑，每三小時取樣一次，冷卻后放入冰箱，48h后統(tǒng)一用752型紫外可見分光光度計測定其OD值。

2.5 TPH降解率的測定

根據(jù)參考文獻[7]，土壤中石油類物質的測定采用紫外分光光度法。采用索式提取法提取土壤中石油類物質，利用紫外分光光度計測出相對應的吸光度，計算每千克干土中石油類物質含量，進而計算出石油類物質降解率 w：

其中w1： 為第1天土壤中石油類物質含量，mg/kg；mi為第i天土壤中石油類物質含量，mg/kg。紫外分光光度法測得原油的標準方程為：

其中：相關系數(shù)R2為0.5591。

為方便計算，將其轉變?yōu)?50 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關系式為：

其中：D為用250mL石油醚萃取含油土樣得到萃取液的有效吸光度，無量綱；M為樣品所含石油類污染物總量，mg。

2.6 微生物計數(shù)法

根據(jù)參考文獻[8]土壤中微生物數(shù)量測定采用平板菌落計數(shù)法。

2.7 實驗設計

本實驗的調節(jié)劑選擇的是容易取材的玉米秸稈，玉米秸稈提前粉碎備用，有機肥選用的是風干牛糞（C/N比為26，速效氮含量為1.7%），并按照油泥（濕重）與玉米秸稈的比例為98：2，油泥（濕重）與有機肥的比例為3：80的，含水率為50%來混合材料。

實驗設計兩個處理，實驗組和對照組，兩個處理均在室內同一條件下進行，底層鋪上防滲塑料布，將所有物料倒在塑料布上，攪拌均勻，堆置起來。同時在兩個堆體里加入發(fā)酵菌劑。上面覆蓋塑料薄膜，以保溫和保濕。中間插入通氣管，通氣管上每隔10cm打一個直徑為1cm的孔，通氣管外接通風設備，以在發(fā)酵過程中控制氧含量。在堆體上分別設置四個監(jiān)測點，測量堆體溫度，并動態(tài)監(jiān)測堆肥過程中堆體的PH、溫度等。當堆體的溫度經歷了升溫，高溫，降溫三個階段，并在溫度降低至40℃左右時，向實驗組堆體里按照5%的比例加入混合降油菌劑，25天時補加一次降油菌劑。對照組不添加菌劑。每7天采樣，測定實驗組和對照組微生物數(shù)量、脫氫酶活性及降油率的變化。

3 結果與討論

3.1 菌株的鑒定

3.1.1 常規(guī)鑒定

對篩選得到的六株菌株進行了菌落特征及菌體形態(tài)特征觀察，以下是各菌株的革蘭氏染色和簡單染色的效果圖示。

鏡檢結果如下圖1及表1所示：

表1 菌落的形狀、質地、顏色及形態(tài)

3.1.2 生理生化測試

首先將篩選出來的六株菌進行生理生化實驗，實驗結果如下表2所示。

表2 生理生化試驗鑒定結果

符號說明：“+”表示該項反應結果為陽性；“-”表示該項反應結果為陰性。

3.1.3 菌種鑒定結果

根據(jù)鏡檢和生理生化試驗結果對照，得到以下結果如表3所示。

表3 常規(guī)鑒定實驗結果

3.2 混合菌劑生長曲線的測定

根據(jù)圖2可知，混合菌在發(fā)酵開始時由于剛剛進入新的環(huán)境，開始時的0~3h菌體處于生長遲緩期，3~21h時間段內菌體迅速生長，處于對數(shù)生長期，21h時菌體吸光度值達到最大值為。21h后菌體生長趨勢開始進入穩(wěn)定期，所以發(fā)酵菌劑時間選定為24h。

圖2 混合菌劑生長曲線

3.3 微生物數(shù)量與TPH降解率的變化關系

控制其他影響條件基本相同，如溫度、酸度、堿度、電導率、C/N、堆體的通氣情況，均在微生物的最適范圍子內。在不考慮其他變量的情況下，以是否加入石油烴降解菌劑作為唯一變量，討論對照組和實驗組微生物數(shù)量與降解幅度的關系。

由圖3可知，微生物的數(shù)量與降解幅度在總體上基本呈相關關系，因微生物數(shù)量較多時，石油烴類化合物被大量分解，降解幅度較大。堆肥0天時，在實驗組加入發(fā)酵菌劑和石油烴復合降解菌劑。此時，堆體的細菌數(shù)較多（約155×107個/g），微生物處于遲滯期，開始適應環(huán)境，不能適應環(huán)境的微生物會死亡，數(shù)量稍有降低。適應環(huán)境的微生物開始利用堆體中的有機物合成自身的細胞結構，遲滯末期，細胞個體變大，開始分裂。此時，細菌數(shù)雖稍有下降，但微生物數(shù)量仍較高，微生物利用石油作為能源進行新陳代謝，堆體中的石油烴類化合物被分解，降解幅度較大（約12%）。從第5天到第17天，微生物數(shù)量增長較快，達到最大340*107個/g，此時，微生物處于對數(shù)期，細菌利用堆體中的營養(yǎng)物質合成細胞結構大量繁殖，分解堆體中復雜有機物為較簡單的有機物。因堆體為牛糞，纖維素含量較高，有機質含量較低，一次發(fā)酵菌劑主要是分解纖維素為較簡單的糖類，利于降油菌劑分解。此時，堆體中的石油烴類化合物被微生物大量分解，降解幅度達到最大（35%左右）。

圖3 微生物數(shù)量與TPH降解率的關系

從第17天到24天，細菌數(shù)量開始下降，細菌開始進入穩(wěn)定期，營養(yǎng)物質稱為主要的限制因素。此時，能被一次發(fā)酵菌劑降解的纖維素已基本被分解，其他營養(yǎng)物質含量也較低，細菌所需營養(yǎng)物質不夠，停止生長分裂，細胞內的有害代謝產物開始積累；當進入衰亡期時，細菌所需營養(yǎng)物質已消耗殆盡，細菌開始進入內源消耗，細胞內的有害代謝產物大量積累，影響細菌的生理活動，此時細菌開始死亡，微生物數(shù)量下降達到最低（約150×107個/g）。當微生物數(shù)量下降時，細菌的降解幅度開始下降，微生物數(shù)量達到最低時，降解幅度為負（約-12%），說明含油量相比上次增加，當微生物死亡時，部分石油烴類殘存在微生物殘體內，并未被分解，或是細菌的代謝物中含有短鏈的脂肪烴類物質，所以含油量增高，降解幅度為負。

從37天開始，對照組加入二次降解菌劑（六株高效降解石油烴類的復合菌劑），微生物數(shù)量又開始大幅度增加（達到400*107個/g），大量利用石油烴類化合物合成細胞自身結構，降解幅度達到隨之增加（達到18%）。此后，微生物數(shù)量開始逐漸降低趨于穩(wěn)定，并逐步接近土壤本底值，降解幅度也趨于穩(wěn)定。

對照組采用未加入降解菌劑的含油污泥和牛糞的堆肥實驗，控制所有變量與實驗組保持相同，由圖3可知，在堆體開始發(fā)酵時，堆體內的微生物也經歷適應期，對數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期，數(shù)量稍有變化，但由于對牛糞中的纖維素利用率較低，造成營養(yǎng)不足，難以大量降解石油烴類化合物，降解幅度幾乎不變（維持在4%左右）。

4 結論

本研究從被長期被原油污染污染的土壤中分離篩選方法篩選出6種降油菌（a1~a6），并通過常規(guī)鑒定和生理生化試驗，得到a1、a2、a3均為芽孢桿菌，a4、a6均為假單胞菌，a5為不動桿菌。通過細菌的復活，一次擴培，發(fā)酵操作，制得混合菌劑。

在實驗室中進行微生物修復石油污染土壤的小試實驗，結果表明，當土壤中石油含量為50g/kg時，加入混合菌劑的石油降解率比沒有加菌劑的降解效率高，添加5%菌劑81d的降解率為90.20%，均大于對照組（只添加有機肥）的降解率31.10%，說明了該混合菌劑具有應用于實際石油污染土壤生物修復的潛力。

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