蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的生化特性、系統(tǒng)進(jìn)化、表達(dá)部位和生理功能的研究

趙紅霞，曾鑫年，梁 勤，張學(xué)鋒，黃文忠，陳華生，羅岳雄*

(1.廣東省昆蟲研究所，廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)業(yè)害蟲綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642;3.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002)

蜜蜂作為一種社會性昆蟲，依賴復(fù)雜豐富的嗅覺信息調(diào)整蜂群的各個方面，包括蜂群管理、任務(wù)分配、尋找蜜粉源、幼蟲-成年蜂相互制約等(Dani，2005;Slessor，2005;LeConte，2008;Swanson，2009)。在蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)中，多種蛋白參與了對氣味分子的識別，在這些蛋白中，氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)扮演了重要的角色，它主要存在于觸角感受器的淋巴液中，作為運(yùn)輸疏水性氣味分子到達(dá)受體的載體(王桂榮等，2002;趙慧婷等，2012)。近年來，國內(nèi)外對昆蟲感受氣味物質(zhì)化學(xué)模式的研究較多，但是對蜜蜂觸角OBPs 的功能研究及其氣味識別機(jī)制研究較少。本文綜述了重要的模式昆蟲-蜜蜂氣味結(jié)合蛋白(OBPs)的研究情況，為深入了解其結(jié)構(gòu)及其功能，科學(xué)飼養(yǎng)和管理蜂群，防治蜜蜂病害提供理論指導(dǎo)。

1 蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的生化特性

蜜蜂基因組(Honeybee Genome Sequencing Consortium)中包含21個編碼氣味結(jié)合蛋白的基因(Forêt and Maleszka，2006)，而目前已知的其他昆蟲 OBPs 家族數(shù)量均高于蜜蜂，果蠅Drosophila melanogaster 中發(fā)現(xiàn)了51個OBPs(Scafe et al.，2002)，岡比亞按蚊Anopheles gambiae 有57個OBPs(Xu et al.，2003)，瘧 蚊Anopheles arabiensis OBPs 家族有32個成員(李正西等，2004)，黃熱蚊Aedes aegypti 基因組中發(fā)現(xiàn)66個OBPs(Zhou et al.，2008)。

蜜蜂氣味結(jié)合蛋白(OBPs)是一類低分子量(一般約為15-18 kDa)的水溶性、酸性的球狀蛋白，等電點(diǎn)4.4-5.2(Deyu，2000)，與赤擬谷盜T.castaneum(Arathi et al.，2007)的OBPs 分子量大小相近，比果蠅(Scafe et al.，2002;Robertson，2003)和岡比亞按蚊(Hill，2002;Xu，2003)的OBPs 分子量小。

2 氣味結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)進(jìn)化

蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和二硫鍵組成，結(jié)構(gòu)相對保守(Picimbon，2001;Briand，2002;劉金香等，2005)。13個OBPs(1-13)屬于傳統(tǒng)的OBPs，典型的結(jié)構(gòu)特征是具有保守的6個半胱氨酸，其排列順序是CysⅠ-Cys Ⅲ，CysⅡ-CysⅤ，CysⅣ-CysⅥ;OBP14 的結(jié)構(gòu)中具有5個半胱氨酸，缺少CysⅤ(Iovinella，2011);OBPs15-21 的序列中含有4個半胱氨酸，缺少CysⅡ和CysⅤ，他們之間的二硫鍵橋消失，這類OBPs 劃為C-minus 端氨基酸;李紅亮等通過對中華蜜蜂Apis cerana cerana 主要觸角特異蛋白(觸角特異蛋白antenna special protein，ASP)進(jìn)行基因克隆和序列分析得出，Ac-ASP1 和Ac-ASP2 均具有6個保守的半胱氨酸，而Ac-ASP3 具有4個保守的半胱氨酸。通過多序列聯(lián)配、系統(tǒng)發(fā)育樹及序列相似性分析，中華蜜蜂AcASPs 除與西方蜜蜂Apis mellifera L.Am-ASP 親緣關(guān)系較近(相似性達(dá)到80%以上)外，與其他膜翅目以及鞘翅目OBPs 及CSPs 也有一定的親緣關(guān)系(相似性達(dá)到30%-60%)，故而得出Ac-ASP1 和Ac-ASP2應(yīng)屬于氣味結(jié)合蛋白OBPs 家族，Ac-ASP3 則屬于化學(xué)感受蛋白家族CSPs(Li et al.，2007)。曹聯(lián)飛等對中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBP5 進(jìn)行了序列分析，擴(kuò)增了中華蜜蜂OBP5 的片段長度為528 bp，其中外顯子序列有294 bp，編碼98個氨基酸殘基;同時，分別采用Kimura 雙參數(shù)距離模型和氨基酸序列構(gòu)建OBP5 鄰接樹，中華蜜蜂與西方蜜蜂為一個類群;選擇壓力檢測顯示中華蜜蜂OBP5 基因處于強(qiáng)烈的負(fù)選擇壓力下，一般負(fù)選擇壓力下的基因功能非常保守，對于維持中華蜜蜂的生長發(fā)育繁殖具有重要的作用。張小輝(2010)等對中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和克隆，得到氣味結(jié)合蛋白基因5、9、11、12 分別編碼143、132、143、150個氨基酸殘基;序列比對后同源性較低;并且序列內(nèi)含有信號肽切割位點(diǎn)，位于22-24個氨基酸殘基之間。

根據(jù)neighbor-joining 法建立蜜蜂OBPs 家族的系統(tǒng)進(jìn)化無根樹，蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的基因obps家族主要分布在9 號染色體和15 號染色體，以成簇形式排列在染色體上;其中基因obp2-8 成簇排列在9 號染色體上，而基因obp9 單獨(dú)零散分布在9號染色體;基因obp13-21 成簇排列在15 號染色體。除此之外，基因obp1 位于2 號染色體，基因obp12 位于12 號染色體;基因obp10 和obp11 分別排列在第10 號染色體上頭和尾位置，大概相距1 kb(圖1)。傳統(tǒng)OBPs 家族基因obp13 和具有4個半胱氨酸的C-minus obps(14-21)均位于15 號染色體，而且obp13 位于C-minus obps 群的樹根部位;因此推測obp13 與C-minus obps 是由傳統(tǒng)OBPs 家族的同一祖先進(jìn)化而來，但基因obp13 中保留了6個半胱氨酸的特征，而C-minus obps 卻只有4個半胱氨酸;C-minus obps 序列之間具有48%相對較高的序列相似性，而蜜蜂氣味結(jié)合蛋白基因obps 家族序列間的相似性較低，序列相似性只有16%(Forêt and Maleszka，2006)。

圖1 蜜蜂氣味結(jié)合蛋白家族OBPs 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(Forêt and Maleszka，2006)Fig.1 Phylogeny of the OBP family in Apis mellifera

3 蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)部位

蜜蜂基因組中9個obps 基因(obp1，obp2，obp4，obp5，obp6，obp8，obp11，obp15，and obp12)主要表達(dá)在成年蜂觸角中，足部和頭部產(chǎn)生弱表達(dá)信號;其次，蜜蜂基因組中7個obps 基因(obp3，obp16，obp17，obp18，obp19，obp20 和obp21)在成年蜂身體的各個部位表達(dá)，可能與身體的各個部位存在化學(xué)感受器相關(guān)，諸如吻、咽和跗骨等部位?；騩bp16-21 主要在成年蜂表達(dá)(部分在蜜蜂蛹后期)，雄蜂上顎腺中也檢測到基因obp18 和基因obp21(Iovinella，2011);除觸角以外，基因obp3 在身體各個部位都有表達(dá)。某些基因obps 只在相對窄的發(fā)育階段表達(dá)，如obp9 與母系遺傳的表達(dá)模式一致，只在蜂王卵巢和早期胚胎中表達(dá)。雖然基因obp10 和obp11 相鄰排列，卻具有不同的時空表達(dá):基因obp10 在蛹期和新出房的蜜蜂中表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量逐漸減弱;而基因obp11 在工蜂觸角中表達(dá)。obp13 主要在幼蟲和蛹中表達(dá)，基因obp14 和obp15 同樣在幼蟲和成蜂中表達(dá)。

中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白(Ac-ASP1)的基因高豐度地表達(dá)于工蜂觸角，而在其它器官(如頭、胸、腹、翅及足)中呈低豐度表達(dá);同時，該基因分別在幼蟲、蛹期到6日齡以及21日齡前后具有兩個表達(dá)高峰且表達(dá)豐度相當(dāng)。Ac-ASP2 特異地表達(dá)于成年工蜂觸角，在幼蟲、蛹及其它器官中均不表達(dá)，在成年工蜂觸角具有幾個較高表達(dá)豐度的日齡，即1、9、15、27、30日齡;Ac-ASP3 除在觸角中表達(dá)外在其它器官中也表達(dá)，但表達(dá)豐度不均一;其次，Ac-ASP3 具有兩個表達(dá)高峰，第一個是蛹期到成年蜂6日齡期間具有高表達(dá);第二個表達(dá)高峰位于成年蜂18日齡前后，其中前者的平均表達(dá)豐度約高于后者的兩倍(李紅亮，2007)。

氣味結(jié)合蛋白OBPs 作為信息素的攜帶者，在蜂王和工蜂的上顎腺表達(dá);同時，上顎腺中分泌大量化學(xué)信息素，只發(fā)現(xiàn)3個obps(13、14、21)基因的明顯表達(dá)。依據(jù)級型和日齡，obp13 表達(dá)量以處女蜂王中最高，然后是剛出房的成年工蜂，表達(dá)量最低是執(zhí)行巢內(nèi)任務(wù)的成年工蜂，幼蟲體內(nèi)也可檢測到該基因，但并未在雄蜂、交配后的蜂王和執(zhí)行采集任務(wù)的工蜂中表達(dá);同時，obp13不僅與日齡有關(guān)，而且出現(xiàn)在相應(yīng)日齡的各個組織部位。油酸作為處女蜂王上顎腺分泌的主要物質(zhì)，隨著蜂王日齡的增加，上顎腺分泌的油酸濃度逐漸減弱。故而推測，該蛋白OBP13 可能具有溶解和釋放油酸的功能。obp21 主要在老蜂上顎腺中表達(dá)，可以結(jié)合蜂王上顎腺釋放的信息素物質(zhì):9-氧代-2-癸烯酸和羥苯甲酯，便于蜂王有效控制工蜂，維持蜂群的發(fā)展。法尼醇是由那氏腺體分泌物質(zhì)，作為蜜蜂的一種追蹤信息素;obp21編碼的蛋白與法尼醇具有極高親和性，通過氣味結(jié)合蛋白OBP21 的介導(dǎo)，便于追蹤信息素及時傳遞至蜜蜂中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)的行為反應(yīng)。obp14 主要在執(zhí)行巢內(nèi)任務(wù)的蜜蜂上顎腺中表達(dá)量最高，其次，幼蟲中也具有豐富的表達(dá);相反，老蜂和幼蜂中具有相對弱的表達(dá)，且未在采集蜂中檢測到該基因(Iovinella et al.，2011)。

4 氣味結(jié)合蛋白的生理功能

在許多陸生動物中，如哺乳動物和昆蟲，水溶性物質(zhì)圍繞在化學(xué)感受神經(jīng)元的周圍，形成對揮發(fā)性、脂溶性分子的天然屏障;這些氣味分子需要被氣味結(jié)合蛋白識別、傳遞至相應(yīng)嗅覺受體。氣味結(jié)合蛋白識別氣味分子介導(dǎo)至嗅覺感受神經(jīng)元的觀點(diǎn)，已被廣泛接受。在氣味識別過程中，OBPs 主要的生理功能如下:(1)OBPs 在氣味識別中起到了外周濾器的作用，能夠選擇性識別和結(jié)合特異的氣味分子;(2)OBPs 通過親水性的淋巴液運(yùn)輸脂溶性氣味分子;(3)OBPs 幫助氣味分子通過特殊途徑到達(dá)受體蛋白，促進(jìn)了信號傳導(dǎo);(4)OBPs 可能清除外周感器中不需要或有毒物質(zhì);(5)OBPs 迅速使完成刺激的氣味分子失活。在昆蟲體內(nèi)其他部位同樣發(fā)現(xiàn)了氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)，它們也可能具有嗅覺識別以外的功能(Zhou，2008)。

根據(jù)氣味結(jié)合蛋白的氨基酸序列同源性和生理功能的不同，一般將昆蟲氣味結(jié)合蛋白分為三類:(1)信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding protein，PBP);(2)普通氣味結(jié)合蛋白Ⅰ(general odorant binding proteinⅠ，GOBPⅠ);(3)普通氣味結(jié)合蛋白Ⅱ(general odorant binding proteinⅡ，GOBPⅡ)。Danty 等(1997，1998)在西方蜜蜂中發(fā)現(xiàn)并確定了一類觸角特異蛋白(antenna special proteins，ASPs)，包括觸角特異蛋白ASP1 和ASP2;這也是在膜翅目昆蟲中首次發(fā)現(xiàn)的氣味結(jié)合蛋白。原位雜交結(jié)果顯示，基因ASP1 在工蜂和雄蜂的觸角嗅覺器官中均大量表達(dá)(Danty，1999)，主要與蜂王信息素物質(zhì)結(jié)合;化學(xué)感受蛋白ASP2 是一種水溶性蛋白，因其高豐度地表達(dá)于工蜂觸角，加之其結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，將化學(xué)感受蛋白ASP2 歸為普通氣味結(jié)合蛋白(Briand et al.，2002)。

文獻(xiàn)報道OBPs 可能具有選擇性結(jié)合的功能，但對于OBPs 具體的識別機(jī)制尚未明確。最初用同位素標(biāo)記信息素或信息素類似物，將其與觸角提取物混合后進(jìn)行非變性電泳(PAGE)和轉(zhuǎn)印后，利用放射性自顯影觀察結(jié)果，鑒定了第一個氣味結(jié)合蛋白(Vandenberg，1987)。該方法不需要純化蛋白，但是在非變性電泳中OBPs/配體復(fù)合物隨時可能會解離導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，并且試驗(yàn)方法復(fù)雜、不安全且昂貴，所以未得到廣泛應(yīng)用(Vogt and Riddiford，1981)。隨后，利用這些蛋白的共同特征，具有內(nèi)源性的色氨酸在結(jié)合口袋內(nèi)部能夠和配體發(fā)生作用后使得熒光值明顯發(fā)生改變，故而用于配體的檢測試驗(yàn)。

通過熒光結(jié)合試驗(yàn)的方法，驗(yàn)證氣味結(jié)合蛋白OBPs 能夠選擇性結(jié)合和區(qū)分不同的信息物質(zhì);編碼氣味結(jié)合蛋白OBPs 的基因通過體外異質(zhì)系統(tǒng)(如在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中)表達(dá)，然后與不同的信息物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn);其中OBPs 除了形成二硫鍵結(jié)構(gòu)外，并沒有其它的轉(zhuǎn)錄后修飾過程，同時已有試驗(yàn)證明體外異質(zhì)表達(dá)的蛋白形成二硫鍵與體內(nèi)氣味結(jié)合蛋白的二硫鍵具有相同功能(Pelosi and Maida，1995;Lartigue，2002)。該實(shí)驗(yàn)利用熒光探針能與OBPs 疏水腔結(jié)合激發(fā)蛋白產(chǎn)生熒光的特性，加入待測試的氣味分子與探針競爭OBPs 結(jié)合，觀察熒光值的變化，氣味分子與氣味結(jié)合蛋白OBPs 結(jié)合能力越強(qiáng)，則將熒光探針從氣味結(jié)合蛋白OBPs 的結(jié)合腔內(nèi)取代的越多，探針激發(fā)的熒光值下降越快，可根據(jù)變化的熒光值計(jì)算解離常數(shù);例如沙漠蝗Schistocerca gregaria 的化學(xué)感受蛋白與芳香族配體的結(jié)合(Ban et al.，2002)和甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae 與溴代衍生物的結(jié)合(Campanacci et al.，2003)。對于蜜蜂OBPs 的熒光結(jié)合試驗(yàn)也有相關(guān)的報道，蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBP13 結(jié)合油酸及其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，氣味結(jié)合蛋白OBP14 結(jié)合單萜類結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，例如異戊基醋酸酯、2-庚酮(蜜蜂釋放的一種報警激素)和丁香酚，與丁香酚結(jié)合效果最好。氣味結(jié)合蛋白OBP21 結(jié)合9-氧代-2-癸烯酸、羥苯甲酯和法尼醇，該蛋白與法尼醇具有極高的親和性，法尼醇是由那氏腺體分泌的一種蜜蜂追蹤信息素物質(zhì);故而提出信息素腺體的OBPs 參與結(jié)合疏水性的化學(xué)信息素，并且協(xié)助釋放或轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)妮d體中。Danty et al.(1999)證實(shí)意蜂化學(xué)感受蛋白ASP1的三維結(jié)構(gòu)與其它昆蟲PBPs 類似，均具有6個螺旋構(gòu)象(Danty et al.，1999);同時，在低pH 環(huán)境下，意蜂化學(xué)感受蛋白ASP1 與配體的結(jié)合能力較強(qiáng)，特別是能與蜂王信息素的主要活性成分特異結(jié)合(Lartigue，2004)，相反，意蜂化學(xué)感受蛋白ASP2 不能與蜂王信息素的任何成分結(jié)合(Danty et al.，1997，1998);李紅亮等(2008)通過體外克隆表達(dá)重組中華蜜蜂化學(xué)感受蛋白AcerCSP3，并利用熒光結(jié)合蛋白試驗(yàn)研究了基于N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN)特異熒光配基，中華蜜蜂AcerCSP3 與花香氣味的結(jié)合作用顯著(Li，2007;李紅亮等，2008);中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白AcerASP2 與萜類物質(zhì)β-紫羅蘭酮具有較強(qiáng)的親和力;同時與其他兩種醛類物質(zhì)(3，4-二甲基苯甲醛和苯甲醛)的結(jié)合力較強(qiáng)(李紅亮等，2013)。

5 蜜蜂OBP 與嗅覺的關(guān)系

自然界中的氣味物質(zhì)有成千上萬種，氣味結(jié)合蛋白在氣味物質(zhì)的傳遞過程中起著重要作用，氣味結(jié)合蛋白選擇性識別結(jié)合一定類別的氣味物質(zhì)，在氣味識別中起著外周濾器的作用。相對于岡比亞按蚊和果蠅，蜜蜂觸角中氣味結(jié)合蛋白的數(shù)量較少。因此，我們推測，相對于其他具有較多數(shù)量OBPs 的昆蟲，可能蜜蜂的嗅覺區(qū)分能力相對較差;或者蜜蜂嗅覺系統(tǒng)借助于其他分子發(fā)揮嗅覺作用。針對蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBPs 數(shù)量較少，提出以下三種假設(shè)，第一，化學(xué)感受蛋白家族具有嗅覺功能，可能具有攜帶氣味物質(zhì)的能力;膜翅目昆蟲的化學(xué)感受蛋白CSPs 比OBPs 具有更多的嗅覺特異性(Ishida et al.，2002;Calvello et al.，2005)，而蜜蜂化學(xué)感受蛋白CSPs 的數(shù)量與果蠅和岡比亞按蚊的CSPs 相近，同時，蜜蜂的部分CSPs 具有嗅覺功能(李紅亮，2007)。第二，蜜蜂嗅覺受體數(shù)量是160-170個(Robertson et al.，2006)，而果蠅嗅覺受體有62個(Robertson et al.，2003)，按蚊有79個嗅覺受體(Hill et al.，2002);恰好與相對較少數(shù)量的氣味結(jié)合蛋白互補(bǔ);蜜蜂OBPs 作為媒介攜帶的氣味分子，易于被較多數(shù)量的氣味受體識別并傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)。第三，研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂具有大量觸角葉，可能具有160-170個觸角葉纖維球，觸角葉中纖維球數(shù)量與蜜蜂嗅覺受體數(shù)量一致，觸角葉內(nèi)的化學(xué)信號整合氣味分子的信息后傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而補(bǔ)償了氣味結(jié)合蛋白數(shù)量少的問題。

蜜蜂依賴氣味結(jié)合蛋白完成了對外界成千上萬氣味物質(zhì)識別過程的第一步，氣味結(jié)合蛋白OBPs 參與識別轉(zhuǎn)移疏水性的氣味物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的嗅覺行為反應(yīng)。

6 展望

對于外界氣味物質(zhì)的嗅覺識別和傳遞過程，蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBPs 作為媒介發(fā)揮了重要作用。目前蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBPs 結(jié)構(gòu)與功能的研究，雖不能完全闡明蜜蜂嗅覺感受機(jī)制，但已經(jīng)明確了蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的生理生化特征和結(jié)合特性等，為將來進(jìn)一步研究蜜蜂對化學(xué)信息的識別、接受、信號傳遞及其相應(yīng)的行為反應(yīng)等奠定了基礎(chǔ);便于掌握蜜蜂間的嗅覺感受機(jī)理，解釋蜜蜂是如何感受和識別環(huán)境中的氣味物質(zhì)，及其相應(yīng)的行為反應(yīng);更重要的是具有極高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價值，且為其他昆蟲或動物提供理論參考。

References)

Arathi HS，HO G，Spivak M.Inefficient task partitioning among nonhygienic honeybees，Apis mellifera L.，and implications for disease transmission［J］.Animal Behaviour，2007，72:431-438.

Briand L，Swasdipan N，Nespoulous C，et al.Characterization of a chemosensory protein(ASP3c)from honeybee(Apis mellifera L.)as a brood pheromone carrier［J］.European Journal of Biochemistry，2002，269(18):4586-4596.

Dani FR，Jones GR，Corsi S.Nestmate recognition cues in the honey bee:differential importance of cuticular alkanes and alkenes［J］.Chemical Senses，2005，30:477-489.

Danty E，Arnold G，Huet JC.Separation characmon and sexual heterogeneity of multiple putative odorant-binding proteins in the honeybee Apis mellifera L.(Hymenoptera:Apidea)［J］.Chemical Senses，1998，23(1):83-91.

Danty E，Briand L，Michard-Vanhee C.Cloning and expression of a queen pheromone-binding protein in the honeybee:An olfactoryspecific，developmentally regulated protein［J］.Journal of Neuroscience，1999，19(17):7468-7475.

Danty E，Michard-Vanhee C，Huet JC.Biochemical characterization，molecular cloning and localization of a putative odorant-binding protein in the honey bee Apis mellifera L.(Hymenoptem，Apidea)［J］.Febs Letters，1997，414(3):595-598.

Deyu Z，Leal W.Conformational isomers of insect odorant-binding proteins［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2000，397(1):99-105.

Forêt S，Maleszka R.Function and evolution of a gene family encoding odorant binding-like proteins in a social insect，the honey bee(Apis mellifera)［J］.Genome Research，2006，16:1404-1413.

Hekmat-Scafe DS，Scafe CR，McKinney AJ.Genome wide analysis of the odorant-binding protein gene family in Drosophila melanogaster［J］.Genome Research，2002，12:1357-1369.

Hekmat-Scafe DS，Scafe CR，McKinney AJ.Genomewide analysis of the odorant-binding protein gene family in Drosophila melanogaster［J］.Genome Research，2002，12:1357-1369.

Hill CA，F(xiàn)ox AN，Pitts RJ，et al.G-protein-coupled receptors in Anopheles gambiae［J］.Science，2002，298:176-178.

Iovinella I，Dani FR，Niccolini A.Differential expression of odorant-binding proteins in the mandibular glands of the honey bee according to caste and age［J］.Journal of Proteome Research，2011，10(8):3439-3449.

Lartigue A，Gruez A，Briand L.Sulfur single-wavelength anomalous diffraction crystal structure of a pheromone-binding protein from the honeybee Apis mellifera L.［J］.Journal of Biology Chemical，2004，279(6):4459-4464.

Lartigue K，Oldroyd B，Spivak M.Seven suggestive quantitative trait loci influence hygienic behavior of honeybees［J］.Naturwissenschaften，2002，89:565-568.

LeConte Y，Hefetz A.Primer pheromones in social hymenoptera［J］.Annual Review of Entomology，2008，53:523-542.

Li HL，Cheng JA，Gao QK.The chemosensory protein of Chinese honeybee，Apis cerana cerana:Molecular cloning of cDNA，immunocytochemical localization and expression［J］.Chinese Science Bulletin，2007，52(10):1355-1364.

Li HL，Nie WM，Gao QK，et al.Cloning of cDNA encoding odorant binding protein ASP2 in working Bee's antenna of Apis cerana cerana and its prokaryotic expression［J］.Scientia Agricultura Sinica，2008，41(3):933-938.［李紅亮，聶文敏，高其康，等.中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白ASP2 cDNA 的克隆及原核表達(dá)［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(3):933-938］

Li HL，Zhang LY，Zhuang SL，et al.Interpretation of odorant binding function and mode of general odorant binding protein ASP2 in Chinese honeybee(Apis cerana cerana)［J］.Scientia Agricultura Sinica，2013，46(1):154-161.［李紅亮，張林雅，莊樹林，等.中華蜜蜂普通氣味結(jié)合蛋白ASP2 的氣味結(jié)合功能模式分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(1):154-161］

Li ZX，Shen ZR，F(xiàn)ield L.Identify olfactory odorant binding protein and gene expression profiling of Anopheles gambiae and A.arabiensis［J］.Science in China(Ser.C Life Sciences).2004，34(3):243-251.［李正西，沈佐銳，F(xiàn)ield L.瘧蚊Anopheles gambiae和A.arabiensis 嗅覺結(jié)合蛋白基因的鑒定和表達(dá)譜分型［J］.中國科學(xué)(C 輯)，2004，34(3):243-251］

Liu JX，Zhong GH，Xie JJ，et al.Recent advances in chemosensory proteins of insects［J］.Acta Entomologica Sinica，2005，48(3):418-426.［劉金香，鐘國華，謝建軍，等.昆蟲化學(xué)感受蛋白研究進(jìn)展［J］.昆蟲學(xué)報，2005，48(3):418-426］

Pelosi P，Maida R.The physiological functions of odorant-binding proteins［J］.Biophysics，1995，40(1):143-151.

Robertson H，Warr C，Carlson J.Molecular evolution of the insect chemoreceptor gene superfamily in Drosophila melanogaster［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003，100:14537-14542.

Slessor KN，Winston ML，LeConte Y.Pheromone communication in the honeybee(Apis mellifera L.)［J］.Journal Chemical Ecology，2005，31:2731-2745.

Swanson J，Torto B，Kells S.Volatile compounds from chalkbrood Ascosphaera apis infected larvae elict honeybee(Apis mellifera)hygienic behavior［J］.Journal of Chemical Ecology，2009，35:1088-1116.

Vandenberg JD，Shimanuki H.Technique for rearing worker honeybees in the laboratory［J］.Apiculture Research，1987，26:90-97.

Vogt RG，Riddiford LM.Pheromone binding and inactivation by moth antennae［J］.Nature，1981，293(5828):161-163.

Wang GR，Guo YY，Wu KM.Progress in the studies of antenna odorant binding proteins of insects［J］.Acta Entomologica Sinica，2002，45(1):131-137.［王桂榮，郭予元，吳孔明.昆蟲觸角氣味結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展［J］.昆蟲學(xué)報，2002，45(1):131-l37］

Xu P，Zwiebel L，Smith D.Identification of a distinct family of genes encoding atypical odorant-binding proteins in the malaria vector mosquito，Anopheles gambiae［J］.Insect Molecular Biology，2003，12:549-560.

Zhang XH，Zhu ZK，Qi YX.Obp 5，9，11，12 gene cloning and bioinformatics analysis of Apis cerana cerana［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2010，4(4):140-142.［張小輝，朱忠珂，祁艷霞.中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白5，9，11，12 基因克隆及生物信息學(xué)分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，4(14):141-143］

Zhao HT，Gao PF，Zhang GX，et al.Advances in research on honeybee olfactory proteins［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2012，49(5):1366-1371.［趙慧婷，高鵬飛，張桂賢，等.蜜蜂嗅覺相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2012，49(5):1366-1371］

Zhou JJ，He XL，Pickett JA.Identification of odorant-binding proteins of the yellow fever mosquitoAedes aegypti:genome annotation and comparative analyses［J］.Insect Molecular Biology，2008，17(2):147-163.