冬蟲夏草菌在寄主鉤蝠蛾幼蟲中的潛伏侵染過程研究

雷 桅，彭青云，張古忍，劉 昕

(中山大學生命科學學院，廣州 510275)

蟲生真菌侵染昆蟲的途徑通常有兩種，其中少量的是通過口腔進入寄主，而余下大多數(shù)則是通過昆蟲表皮侵入體內?？谇磺秩狙芯枯^少，一般認為病原微生物主要從中腸侵入血腔。表皮侵染機制存在于大量真菌中，特別是生物防治領域，其中白僵菌、綠僵菌等研究較為深入，其過程可分為10個階段:分生孢子附著、分生孢子在昆蟲表皮上萌發(fā)、穿透表皮、菌絲在血腔內生長、毒素的產(chǎn)生、寄主死亡、菌絲侵入寄主的所有器官、菌絲穿出表皮、產(chǎn)生侵染單位、侵染單位擴散(蒲蜇龍和李增智，1996)。然而，由于種種原因，冬蟲夏草菌的侵染機理至今仍幾乎一無所知，因此有人推測該菌應該與其他蟲生真菌類似，是通過表皮侵染進入鉤蝠蛾幼蟲(陸龍喜等，2002)，而也有文獻推論冬蟲夏草菌可能經(jīng)口腔進食途徑侵入寄主(Zhang et al.，2008)，但迄今仍無確切證據(jù)支持哪種途徑才是冬蟲夏草菌的侵染方式。

冬蟲夏草是青藏高原特色名貴中藥材，，具有極高的藥用和經(jīng)濟價值，自然資源十分稀少且至今仍無法人工培植(Yue et al.，2013)。它是冬蟲夏草菌(冬蟲夏草無性型:中國被毛孢Hirsutella sinensis)寄生于鱗翅目 Lepidoptera 蝠蛾科Hepialidae 鉤蝠蛾屬Thitarodes 幼蟲后形成的蟲生子囊真菌，其發(fā)生機理一直是學術界非常關注卻難以破解的課題，并極大地阻礙了冬蟲夏草可持續(xù)利用關鍵技術的發(fā)展，也挑戰(zhàn)著蟲生真菌領域的廣大科研工作者。其中首要問題就是冬蟲夏草菌的侵染途徑，即它是如何侵入寄主幼蟲體內的(Zhong et al.，2010;Hu et al.，2013)，從而進一步在某種條件下，子座開始形成并繼續(xù)長出地面，由此啟動冬蟲夏草的有性階段。依據(jù)目前已知的其他蟲生真菌的侵染方式，推測冬蟲夏草菌可能存在的潛伏侵染途徑，一種可以稱之為內向型，即環(huán)境中的冬蟲夏草菌以幼蟲表皮為突破口，通過附生在表皮上，然后基于一系列物理刺入或酶學溶解等過程進入體腔，從組織順序的角度而言，就是表皮＞脂肪體＞血淋巴＞腸壁;另一種則可稱為外向型，即環(huán)境中的冬蟲夏草菌首先定殖于植物根系，然后隨著幼蟲攝食過程從口腔進入腸道，并主動穿透或依賴于消化系統(tǒng)侵染蟲體，直至進入體腔，實現(xiàn)對寄主的感染，其組織過程可概括為:腸壁＞血淋巴＞脂肪體＞表皮(蒲蜇龍和李增智，1996)。本研究應用Holt 指數(shù)平滑法模型評估冬蟲夏草菌在幼蟲各組織中水平遷移的線性趨勢，并依據(jù)上述兩種潛在侵染模式，分別進行建模評估，比較分析兩者存在的可能性和可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與生境調查

西藏東南部的色季拉山海拔4000-4600 m 間是良好的冬蟲夏草發(fā)生地，在4156 m 海拔處建立有“中山大學青藏高原特色資源科學工作站”被用于冬蟲夏草原生態(tài)生物學的科學研究。從海拔3800 m 起往上行，每隔200 m 設一個采樣點，每個點采集5 條寄主蒲氏鉤蝠蛾幼蟲，齡期為3-6 齡，帶回備用。

1.2 DNA 的制備

使用DNA 抽提試劑盒提取鉤蝠蛾幼蟲表皮、脂肪體、血淋巴和腸壁等組織中的基因組DNA，然后結合NanoDrop 2000 超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測其濃度、質量和完整性，最終總DNA 被儲存于-80℃超低溫冰箱中。

所有DNA 提取方法都按照AxyPrep 基因組DNA 小量試劑盒(Axygen 生物技術有限公司)說明書進行。

1.3 qPCR 擴增

基于Real-time qPCR 方法建立了高靈敏度和高特異性的冬蟲夏草菌實時定量檢測技術體系(R2＞0.999)，包括物種特異性引物IF2(5'-GCAGTGGCATCTCTCAGTCA-3')和IR2(5'-GCATTTCGCTGCGTTCTT-3')，并以提取的各幼蟲表皮、脂肪體、血淋巴和腸壁等組織DNA 為模板，檢測其中的ITS 拷貝數(shù)，后換算成冬蟲夏草菌定殖量。反應體系為:樣本基因組DNA 5.0 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，最后以ddH2O 補至20 μL。每個重復測定3 次(Lei et al.，2013)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與數(shù)學建模

為了深入探討冬蟲夏草菌侵染寄主幼蟲的途徑問題，即表皮侵染途徑(外向型outward)或者口腔侵染途徑(內向型inward)。需要特別說明的是，表皮、脂肪體、血淋巴和腸道是相互聯(lián)系但各自獨立的組織，冬蟲夏草菌在其上的定殖和迭續(xù)將遵守方向性的線性關聯(lián)。本研究采用了Holt線性趨勢的指數(shù)平滑法模型，該模型適用于具有線性趨勢且無季節(jié)性的序列，其平滑參數(shù)是水平和趨勢，不受相互之間的值約束。Holt 模型比Brown 模型更通用，但在計算大序列時要花的時間更長。Holt 指數(shù)平滑法與ARIMA 模型極為相似，包含零階自回歸、二階差分以及二階移動平均數(shù)(Gardner，1958;Gardner，2006)。

2 結果與分析

2.1 不同緯度產(chǎn)區(qū)中鉤蝠蛾幼蟲體內冬蟲夏草菌定殖量的比較分析

圖1 不同緯度產(chǎn)區(qū)寄主鉤蝠蛾幼蟲體內的冬蟲夏草菌定殖量對比Fig.1 Colonization of Ophiocordyceps sinensis in the tissues of Thitarodes larvae

圖2 評估模型的擬合度Fig.2 Evaluation of the degree of fitting of the model

如圖1 可知，在寄主鉤蝠蛾體內血淋巴中的冬蟲夏草菌含量最低。昆蟲的血淋巴，兼有血液和淋巴樣組織液的特性，其作用是營養(yǎng)物質運輸、體腔清潔、溫度調節(jié)、防御免疫和創(chuàng)傷愈合等，因此對于生理狀態(tài)完全正常的幼蟲而言，血淋巴中的菌含量不可能很高。

同時，我們也發(fā)現(xiàn)腸壁定殖有大量的冬蟲夏草菌，這來源于進食過程中隨根系和土壤到達腸道，而消化系統(tǒng)也能為菌體的生長提供充足的營養(yǎng)和能量物質，所以腸壁就構成了鉤蝠蛾幼蟲體內的一個菌庫(Lei et al.，2011)。

蒲氏鉤蝠蛾幼蟲表皮攜帶有相對最多冬蟲夏草菌，同時我們在該地土壤中檢測到大量目標菌，而且植物根系也被證實含有高豐度的冬蟲夏草菌(Peng et al.，2013)，這說明鉤蝠蛾表皮的帶菌狀態(tài)與周邊土壤和植被環(huán)境密切相關。

2.2 冬蟲夏草菌在寄主幼蟲中潛伏侵染的趨向推測

(1)起始于表皮的潛伏侵染途徑(內向型，inward)模式

圖3 殘差自相關函數(shù)圖Fig.3 Residuals autocorrelation plot

表1 指數(shù)平滑法模型參數(shù)Table 1 Exponential Smoothing Model parameters

圖4 模型趨勢圖Fig.4 Holt model trend

(2)起始于腸道的潛伏侵染途徑(外向型，outward)模式

圖5 評估模型的擬合度Fig.5 Evaluation of the degree of fitting of the model

圖6 殘差自相關函數(shù)圖Fig.6 Residuals autocorrelation plot

表2 指數(shù)平滑法模型參數(shù)Table 2 Exponential Smoothing Model parameters

對比上述兩個模型，反映了方向相反的兩個過程，其中起始于表皮的內向型模型為0.678，起始于腸道的外向型模型為0.271。這兩個R2值都不高，說明冬蟲夏草菌在幼蟲體內的增殖遷移過程并不簡單，不是單一地依賴某一種途徑，而是還受到其他多方面的影響。相對而言，內向型模式的R2值比外向型模式高出近3 倍，說明這兩種途徑均有可能存在，但后者發(fā)生的過程會伴隨更多的影響因素。

圖7 模型趨勢圖Fig.7 Holt model trend

在相關工作中，我們已經(jīng)證實在冬蟲夏草發(fā)生地的土壤和植物等環(huán)境中都生活著大量冬蟲夏草菌，因此幼蟲表皮接觸和感染該菌的機會較大，但表皮的防護結構和功能較強，對菌群的侵入會造成一定的限制;而腸道里的定殖菌只能通過攝食帶菌植物根系的方式進入，途徑和來源比較有限，而且還與植物本身的帶菌豐度、腸道里的pH值、消化系統(tǒng)里的多種溶菌抑菌活性物質等有關。總之，基于本研究的模擬研究結果，雖然依據(jù)真菌侵染昆蟲的傳統(tǒng)觀念，冬蟲夏草菌的表皮接觸侵染方式具有可行性;但起始于腸道定殖菌群，并自腸壁侵入和感染體腔的模式也具有一定的潛在可能性，應在冬蟲夏草發(fā)生機理的研究中被重點關注。

3 結論與討論

內生冬蟲夏草菌的侵染途徑和寄生進程被認為是冬蟲夏草發(fā)生發(fā)育的關鍵影響因素，但由于實驗手段的缺乏和培養(yǎng)條件的嚴苛，這一過程尚無法實現(xiàn)人工復制(Zhang et al.，2008;Shrestha et al.，2011)，給冬蟲夏草的發(fā)育機理研究和產(chǎn)業(yè)化培植帶來巨大困難，而當前最大挑戰(zhàn)是揭示冬蟲夏草菌如何侵入宿主并造成感染的病理性進程(Li et al.，2000;Dong et al.，2010)。

冬蟲夏草作為一種蟲生真菌，與已被深入研究的金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae 和球孢白僵菌Beauveria bassiana 等類似，也被認為具有典型的雙型現(xiàn)象。冬蟲夏草菌對寄主鉤蝠蛾幼蟲的帶菌生長、侵染、寄生和致病等重要環(huán)節(jié)都依賴于該菌的定殖和增殖，所以要解析冬蟲夏草發(fā)生的過程必須要量化冬蟲夏草菌種群在寄主和生態(tài)環(huán)境中的變化。由于冬蟲夏草菌形態(tài)不定，生長速度極其緩慢，培養(yǎng)條件又非?？量?，而且至今仍無法從鉤蝠蛾幼蟲、植物和土壤等環(huán)境中直接分離獲得，因此無法像其它病原菌那樣通過分離和純培養(yǎng)來進行定量分析，故基于現(xiàn)代分子生物學手段，建立和開發(fā)冬蟲夏草菌實時定量檢測技術將非常必要。

本文采用real-time qPCR 技術檢測了冬蟲夏草適生地蒲氏鉤蝠蛾幼蟲體內冬蟲夏草菌的定殖量，探討冬蟲夏草菌群的寄生量及其種群變化趨勢的時空模式，從而證實了幼蟲帶菌生長理論(齊麗麗，2010)。在此基礎上，分別建立了起始于表皮的潛伏侵染途徑和起始于腸道的潛伏侵染途徑兩種數(shù)學模型。經(jīng)過比較分析后，推論冬蟲夏草菌隨口腔攝食侵染寄主幼蟲的方式具有一定合理性和可行性，表明冬蟲夏草菌可以通過進食途徑實現(xiàn)其對鉤蝠蛾幼蟲的帶菌生長、侵染和寄生，從而進一步支持了高寒宿主植物在冬蟲夏草發(fā)生過程中的作用(雷桅，2012)，完善了冬蟲夏草菌與寄主昆蟲之間的關系及冬蟲夏草的生活史，為進一步揭示冬蟲夏草的發(fā)生機理提供了重要依據(jù)。

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