早產(chǎn)大鼠宮內(nèi)感染肺損傷時(shí)支氣管肺泡灌洗液及肺組織中脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)*

王 偉，蔡麗霞，崔志瑞，羅向陽(yáng)

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒科鄭州450052

△女，1973年10月生，博士，副教授，研究方向:新生兒及兒童遺傳代謝內(nèi)分泌，E-mail:weiwang169@126．com

新型支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是常見(jiàn)于早產(chǎn)兒的一種呼吸系統(tǒng)疾病，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)。宮內(nèi)感染引起肺微血管發(fā)育障礙，肺泡合成受阻可能是其發(fā)生發(fā)展的重要原因［1-2］，但其發(fā)病機(jī)制目前不清。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知最有效的調(diào)控肺微血管生成和發(fā)育的血管生成素蛋白［3］。課題組前期研究［4-5］發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)炎性暴露可引起肺組織VEGF 及其受體表達(dá)減少，肺組織細(xì)胞增殖受抑制，發(fā)生類似BPD 的病理改變。新近研究［6］發(fā)現(xiàn)脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)是調(diào)節(jié)肺巨噬細(xì)胞活性的重要因子，同時(shí)又為VEGF 基因下游因子，其表達(dá)受VEGF 調(diào)控。該實(shí)驗(yàn)對(duì)孕15 d SD 大鼠進(jìn)行脂多糖(LPS)羊膜腔內(nèi)注射，觀察宮內(nèi)感染肺損傷時(shí)支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織中FABP4 的表達(dá)，探討炎癥對(duì)肺微血管發(fā)育及重塑的影響及與BPD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 主要材料 健康SD 大鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。LPS 購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。FABP4 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司，總RNA 提取試劑(商品名Trizol)購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司。小鼠抗FABP4 單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司。隨機(jī)引物、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑及Taq DNA 聚合酶購(gòu)于美國(guó)Promega 公司。FABP4 引物(表1)由上海英駿公司合成。

表1 PCR 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1．2 動(dòng)物模型的制備及分組 參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法［4-5］。選擇定期受孕的SD 大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成2組:LPS組和對(duì)照組，于孕15 d 打開(kāi)孕鼠腹腔，用微量加樣器將LPS(40 g/L)注射于羊膜腔內(nèi)，每個(gè)孕囊5 μL。對(duì)照組注入等體積生理鹽水。早產(chǎn)鼠于孕21 d(預(yù)產(chǎn)期為22 d)剖宮娩出，由當(dāng)日分娩的母鼠作其代母鼠。2組大鼠均于不同時(shí)間點(diǎn)即:出生后第1天(P1)、第4天(P4)及第7天(P7)各取8只，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%烏拉坦0．5 mL腹腔麻醉，氣管插管保持肺充氣狀態(tài)，開(kāi)胸放血，右支氣管結(jié)扎，迅速切取右肺，用4℃無(wú)菌生理鹽水對(duì)左肺行肺泡灌洗(2．5 mL×3次)，回收率＞85%，將BALF 在4℃條件下以4 000 r/min 離心10 min，取上清，保存在－80℃冰箱中待測(cè)。

1．3 BALF 中FABP4 含量測(cè)定 采用ELISA 法檢測(cè)BALF 中FABP4 含量，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1．4 免疫組化法檢測(cè)肺組織中FABP4 蛋白的表達(dá)采用SP 法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)為3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過(guò)夜，0．01 mol/L PBS充分洗滌后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(37℃30 min)，DAB 顯色，復(fù)染封片，鏡下觀察。結(jié)果判定以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照為0．01 mol/L PBS 代替一抗。FABP4抗體稀釋度均為1 ∶100。每張切片于光鏡下(×200)選取5個(gè)視野，固定窗口面積，利用HMIAS-2000 高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度(A)值，以表示FABP4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1．5 RT-PCR 檢測(cè)肺組織中FABP4 mRNA 的表達(dá) 采用Trizol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:94．0℃預(yù)變性5 min;94．0℃變性45 s，72．0℃延伸1 min，53．6℃退火45 s，反應(yīng)32個(gè)循環(huán);最后72．0℃延伸7 min。然后用15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳30 min。采用MUVB220 凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)Ultralum 公司)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，分別測(cè)定各條帶A 值，以目的基因條帶與內(nèi)參β-actin 條帶A 值的比值作為FABP4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組BALF 中FABP4 含量、肺組織中FABP4 蛋白及mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較采用2 ×3 析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 2組早產(chǎn)大鼠BALF 中FABP4 含量的變化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 2組早產(chǎn)大鼠BALF中FABP4 含量的變化(n=8) ng/L

2．2 2組早產(chǎn)大鼠肺組織中FABP4 蛋白的表達(dá)FABP4 主要表達(dá)在肺巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)2組早產(chǎn)大鼠肺組織中FABP4 蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表3 2組早產(chǎn)大鼠肺組織中FABP4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n=8)

2．3 2組早產(chǎn)大鼠肺組織中FABP4 mRNA 的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2、表4。

圖2 2組早產(chǎn)大鼠肺組織中FABP4 mRNA 的表達(dá)

表4 2組早產(chǎn)大鼠肺組織中FABP4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量(n=8)

3 討論

新近研究［6-10］認(rèn)為宮內(nèi)感染是引起新型BPD發(fā)生的重要因素。FABP4 是調(diào)控肺部炎癥反應(yīng)的重要因子，又是肺微血管生成重要調(diào)控因子VEGF及其受體2 的下游因子，其與VEGF 互為調(diào)控。FABP4 基因敲除小鼠受到炎癥刺激時(shí)巨噬細(xì)胞不能分泌IL-1β、TNF-α 等促炎因子;受外源性VEGF干預(yù)后，支氣管微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖受阻，支氣管毛細(xì)血管網(wǎng)生成密度降低，支氣管發(fā)育障礙［11-12］。

該研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染肺損傷早期肺組織中FABP4 表達(dá)增加，隨著肺損傷修復(fù)及發(fā)育，F(xiàn)ABP4表達(dá)減少，逐漸恢復(fù)到正常對(duì)照水平。課題組前期研究［4-5］發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染肺損傷時(shí)VEGF 及其受體2的表達(dá)時(shí)相與該研究中FABP4 的表達(dá)時(shí)相正好相反。其可能機(jī)制為:①由于肺微血管的發(fā)育包括支氣管微血管的發(fā)育和肺泡微血管的發(fā)育。VEGF 主要由肺泡上皮細(xì)胞合成，通過(guò)旁分泌途徑作用于肺泡微血管。而FABP4 則主要由肺泡巨噬細(xì)胞及支氣管血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，作用于支氣管微血管。因此，宮內(nèi)感染肺損傷時(shí)，二者反應(yīng)可不同［6，13］。②宮內(nèi)感染肺損傷早期由于肺巨噬細(xì)胞大量流入、聚集，導(dǎo)致FABP4 表達(dá)增加。大量分泌的FABP4 促進(jìn)支氣管微血管大量生成的同時(shí)，又抑制VEGF 及其受體2 表達(dá)，使肺泡微血管生成受阻［11］。③隨著肺損傷的修復(fù)，肺巨噬細(xì)胞聚集減少，F(xiàn)ABP4 表達(dá)減少，通過(guò)調(diào)控使VEGF 及其受體2 表達(dá)增加，肺泡微血管大量生成，但新合成的肺泡毛細(xì)血管呈不連續(xù)性，通透性差，為病理性重塑［14］。

該研究還發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染肺損傷時(shí)，隨著肺發(fā)育，BALF 中FABP4 含量逐漸增加，與肺組織中的FABP4 表達(dá)時(shí)相并不完全一致。這可能是因?yàn)閷m內(nèi)感染肺損傷早期，炎性因子損傷肺泡和毛細(xì)血管基底膜，使肺血管通透性增加，F(xiàn)ABP4 外滲，而以后雖然肺組織開(kāi)始修復(fù)，但由于肺微血管為病理性重塑，F(xiàn)ABP4 仍然能通過(guò)毛細(xì)血管基底膜外滲，引起B(yǎng)ALF 中FABP4 表達(dá)持續(xù)增加［15］。

綜上所述，宮內(nèi)感染肺損傷早期，F(xiàn)ABP4 表達(dá)增加，而隨著肺損傷修復(fù)，F(xiàn)ABP4 表達(dá)逐漸減少。FABP4 與肺組織VEGF 及其受體表達(dá)時(shí)相正好相反，從而導(dǎo)致肺微血管合成障礙，發(fā)生病理性重塑，肺泡化過(guò)程受阻，進(jìn)而導(dǎo)致新型BPD 的發(fā)生。

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