郭文靜，樊紅琨，鄭春光，張桂紅，段 萍，楊 陽，羅天霞，章 茜#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 鄭州450001 2)河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院生理學(xué)教研室 安陽455001

Junctophilins(JPs)是偶聯(lián)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)離子通道交通的分子基礎(chǔ)，并具有膜偶聯(lián)復(fù)合物(junctional membrane complexes，JMCs)特性的一類蛋白［1-2］。已知JPs 存在4種亞型，分別為JP1、JP2、JP3 和JP4。JP2 主要存在于骨骼肌和心肌，敲除JP2 可導(dǎo)致興奮-收縮失偶聯(lián)，進(jìn)而引起心肌和骨骼肌收縮障礙［3-4］。SK 通道是依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活的K+通道，其中SK2 通道存在于心肌細(xì)胞膜，包括T 管膜［5］。研究［6］表明SK2 通道參與動(dòng)作電位復(fù)極化過程，與室上性心律失常發(fā)生的分子機(jī)制相關(guān)。作者之前的研究［7］表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)可影響SK2 通道的功能。該實(shí)驗(yàn)采用RNA 干擾(RNAi)技術(shù)研究沉默JP2 基因，觀察對(duì)新生小鼠心肌細(xì)胞(neonatal mouse cardiomyocytes，NMCMs)SK2 通道的影響。

1 材料與方法

1．1 靶向小鼠JP2 的siRNA 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)siRNA 的設(shè)計(jì)原則及文獻(xiàn)［8］報(bào)道，針對(duì)Gen-Bank 中小鼠JP2 基因(NM_001205076．1)的2個(gè)不同 位 點(diǎn)(5'-GCCACAATGTGCTGGTCAA-3'，5'-GT GATCTTGCTGAA-3')，分別設(shè)計(jì)2 對(duì)靶向JP2 基因并帶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)的DNA 互補(bǔ)序列和RNAi陰性對(duì)照(negative control，NC)序 列(5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3')。經(jīng)Blast 軟件分析確定序列的特異性。上述序列的合成及重組慢病毒質(zhì)粒(LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2 和LV-NCEGFP)的包裝和收獲由上海吉?jiǎng)P基因有限公司完成。

1．2 NMCMs 的培養(yǎng) 取出生1～2 d 的昆明小鼠心臟剪碎，37℃低速離心，用含EDTA 的胰蛋白酶(Hyclone 公司)消化，收集細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于35 mm 培養(yǎng)皿，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育90 min。取上清接種于24 孔板，加入5-Brdu 使其終濃度為0．1 mmol/L，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育，36 h 后換液。

1．3 重組慢病毒質(zhì)粒感染NMCMs 將生長良好、融合至50% 的細(xì)胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2 和LV-NC-EGFP，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Ctrl-NC)作對(duì)照，48 h 后熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)情況。2．5 g/L 胰蛋白酶消化NMCMs。收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測感染效率。

1．4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測JP2 mRNA 的表達(dá)收集感染48 h 的細(xì)胞，采用Trizol 法抽提總RNA，37℃DNase 處理，合成cDNA 第一條鏈(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。JP2 基因引物序列:上游5'-CTGGCTATCCTATTTGTTCAC CT-3'，下 游5'-GTTTTAGGTCCGAAGTCCCAT-3'，產(chǎn)物大小135 bp。內(nèi)參(GADPH)基因引物序列:上游5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'，產(chǎn)物大小183 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR 總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件:95℃2 min;95℃10 s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。制備熔解曲線:95℃變性1 min，冷卻至55℃，使得DNA 雙鏈充分結(jié)合;從55℃起到95℃，每一步增加0．1℃，保持4 s，同時(shí)讀取吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。JP2 mRNA 以其與內(nèi)參基因吸光度比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1．5 Western blot 檢測SK2 通道蛋白的表達(dá) 收集感染72 h 細(xì)胞，－80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。提取各組細(xì)胞蛋白，100 g/L SDS-PAGE 分離SK2，電泳，轉(zhuǎn)膜，50 g/L 脫脂牛奶-TBS 室溫封閉1 h，加入兔多克隆抗SK2 抗體(1 ∶300 稀釋，Alamone labs)或β-actin (1∶600 稀釋，美國Sigma 公司)，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀釋)，室溫孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光曝光顯影。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗(yàn)比較各組間JP2 mRNA 表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 重組慢病毒質(zhì)粒對(duì)NMCMs 的感染 NMCMs生長狀態(tài)良好，形態(tài)正常(圖1A)，倒置熒光顯微鏡下可見明顯的GFP 表達(dá)(圖1B)。Ctrl-NC組心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為0，LV-JP2-RNAi-1 和LVJP2-RNAi-2組心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別達(dá)70% 和80%。

圖1 NMCMs 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的觀察(×10)

2．2 各組細(xì)胞JP2 mRNA 水平 見表1。

表1 各組細(xì)胞JP2 mRNA 表達(dá)水平

2．3 各組細(xì)胞SK2 通道蛋白的表達(dá) 與Ctrl-NC及LV-NC-EGFP組細(xì)胞比較，LV-JP2-RNAi-2組細(xì)胞SK2 通道蛋白的表達(dá)明顯被抑制，見圖2。

圖2 各組細(xì)胞SK2 通道蛋白的表達(dá)

3 討論

在心肌細(xì)胞，由T 管膜和肌質(zhì)網(wǎng)膜形成二聯(lián)體膜偶聯(lián)復(fù)合物，后者是實(shí)現(xiàn)心肌興奮-收縮偶聯(lián)的重要結(jié)構(gòu)基質(zhì)［9］。SK2 通道表達(dá)于心肌細(xì)胞膜，包括T 管膜，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是激活SK 通道的惟一因素［10］。JP2 功能異?？捎绊懠?xì)胞膜表面離子通道與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的偶聯(lián)，直接影響心肌或骨骼肌興奮-收縮偶聯(lián)過程，導(dǎo)致收縮障礙，如果敲除JP2，動(dòng)物將于胚胎期死亡［11-12］。

RNAi 是一種序列特異性的、由雙鏈RNA 誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，siRNA 可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)周甚至更久，具有經(jīng)濟(jì)、快捷、高效等顯著優(yōu)勢，成為RNAi 研究的首選方法［13］。該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建靶向JP2 的siRNA 慢病毒載體，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明它可在心肌細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。該研究將該慢病毒載體轉(zhuǎn)染至NMCMs，可有效地沉默心肌細(xì)胞JP2 mRNA 表達(dá)，并可抑制小鼠心肌細(xì)胞SK2 通道的表達(dá)。

總之，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入研究JP 與SK 通道在小鼠心肌動(dòng)作電位中的作用及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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