王莉娜，周世媛，張 華，王鳳羽，謝建生，楊 博，周繼蘋

1)河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院優(yōu)生遺傳室 鄭州450002 2)深圳市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心 深圳518000 3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州450052

△女，1979年10月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:出生缺陷干預(yù)、產(chǎn)前診斷，E-mail:wangliyana1979@126．com

22q11．2 微缺失綜合征(22q11．2 microdeletion syndrome，22q11．2DS)也稱為顎心面綜合征或Digeorge 綜合征，主要是由于22q11．2 微缺失所致，發(fā)病率為1∶4 000［1］。該病患者主要臨床表現(xiàn)是:先天性心臟病(特別是圓錐動(dòng)脈干畸形)、顎異常、特征性面容、學(xué)習(xí)困難、免疫缺陷等［2］。該病為常染色體顯性遺傳病，大部分為新發(fā)突變［3］。臨床上對(duì)該病的治療尚無有效的方法，因此早診斷、早治療非常重要。目前對(duì)22q11．2DS 的實(shí)驗(yàn)室診斷主要是采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)。2種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，作者聯(lián)合使用2種檢測手段對(duì)可疑22q11．2DS 胎兒進(jìn)行檢測，同時(shí)進(jìn)一步分析22q11．2DS 的基因檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象及樣本采集 孕婦，女，30歲，平素月經(jīng)規(guī)律，身體未發(fā)現(xiàn)其他異常情況。孕24 周胎兒彩超系統(tǒng)篩查顯示:胎兒心臟發(fā)育異常(法洛四聯(lián)癥合并房間隔缺損)。孕婦在穿刺前行血常規(guī)、凝血四項(xiàng)、傳染病、胎兒超聲等常規(guī)檢查。在無發(fā)熱、穿刺部位無敏感不適、無凝血異常、胎兒羊水量足夠的情況下，告知相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，孕婦簽署知情同意書后行羊膜腔穿刺。然后采集孕婦及其丈夫的全血樣本。

1．2 樣本處理

1．2．1 羊水樣本DNA 提取 取5 mL 羊水樣本，3 000 r/min 離心10 min，棄上清，利用Thermo Scientific King Fisher 自動(dòng)磁珠提取純化儀從羊水胎兒脫落細(xì)胞提取基因組DNA。

1．2．2 全血樣本DNA 提取 取200 μL 全血樣本，利用Thermo Scientific King Fisher 自動(dòng)磁珠提取純化儀從全血中提取基因組DNA。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法 羊水和全血樣本進(jìn)行常規(guī)染色體核型分析的同時(shí)，另取準(zhǔn)備好的羊水樣本和全血樣本的基因組DNA 進(jìn)行MLPA 檢測，異常結(jié)果的樣本再進(jìn)行FISH 檢測。

1．3．1 MLPA 檢測 采用荷蘭MRC-Holland 公司的微缺失檢測試劑盒進(jìn)行檢測。將準(zhǔn)備好的基因組DNA 依次進(jìn)行變性、雜交、MLPA 連接反應(yīng)和常規(guī)PCR，最后將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在CEQ8800 Genetic Analysis 分析儀進(jìn)行電泳。CEQ8800 Genetic Analysis分析儀收集熒光信號(hào)并自動(dòng)生成MLPA 圖譜。用MRC-Holland 公司提供的GeneMarker 軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析。

1．3．2 羊水、全血培養(yǎng)后染色體核型分析 羊水、全血培養(yǎng)后按照常規(guī)步驟進(jìn)行染色體核型分析［4］。

1．3．3 FISH 檢測 采用雙色熒光探針進(jìn)行檢測。目標(biāo)基因?yàn)?2q11．2 區(qū)域的TUPLE1 基因，顯示紅色熒光信號(hào);對(duì)照基因?yàn)?2q13．3 區(qū)域的ARSA 基因，顯示綠色熒光信號(hào)。按照FISH 常規(guī)操作程序進(jìn)行制片、干燥、變性、雜交、后洗、染色和鏡檢。

2 結(jié)果

2．1 常規(guī)染色體核型分析結(jié)果 羊水和全血樣本常規(guī)染色體核型分析結(jié)果顯示，均未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常。

2．2 MLPA 檢測結(jié)果 與22q11．2DS 相關(guān)的探針有6個(gè)，胎兒的電泳圖(圖1)顯示，22q11．21 區(qū)域196、208、371 信號(hào)均降低約0．5。胎兒父母的電泳圖中未見異常。

圖1 MLPA 檢測擴(kuò)增電泳圖

2．3 FISH 檢測結(jié)果 正常細(xì)胞顯示:單個(gè)中期細(xì)胞核中紅色信號(hào)及綠色信號(hào)均為2個(gè)。異常細(xì)胞顯示:紅色信號(hào)1個(gè)，綠色信號(hào)2個(gè)，表示TUPLE1 基因發(fā)生缺失;紅色信號(hào)2個(gè)，綠色信號(hào)1個(gè)，表示ARSA 基因發(fā)生缺失。FISH 檢測結(jié)果顯示為TUPLE1 基因發(fā)生缺失(圖2)。

圖2 FISH 檢測羊水樣本的熒光圖(×1 000)

3 討論

先天性心臟病是一類因胚胎期心血管系統(tǒng)發(fā)育異常所引起的先天性的畸形，是我國出生缺陷檢測的重大疾病之一。病因有三大類:遺傳、環(huán)境、遺傳與環(huán)境共同作用。其中遺傳因素中常見的是染色體異常(如21 三體綜合征和18 三體綜合征)，現(xiàn)有研究［5］證實(shí)22q11．2DS 是最常見的引起先天性心臟病的遺傳因素之一。對(duì)于22q11．2DS 的診斷，細(xì)胞遺傳學(xué)水平的檢測不能滿足臨床的需要。該實(shí)驗(yàn)常規(guī)細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果顯示全血和胎兒樣本的染色體核型分析均正常，無法檢測到22q11．2DS。目前檢測22q11．2DS 的方法還有FISH 檢測、MLPA 檢測和全基因組微陣列檢測。FISH 檢測因其探針數(shù)有限，僅能檢測到與探針相對(duì)應(yīng)的缺失，該實(shí)驗(yàn)中FISH 方法僅檢測TUPLE1 基因缺失;但是FISH 技術(shù)對(duì)操作者的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求相對(duì)較高。而全基因組微陣列技術(shù)無論對(duì)人員還是對(duì)設(shè)備要求均較高。MLPA技術(shù)將DNA 探針技術(shù)和PCR 技術(shù)相結(jié)合，能夠快速、高通量、方便、精確地檢測出基因變異和變異位點(diǎn)［6］。該實(shí)驗(yàn)采用MLPA 技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果尋找到了3種與22q11．2DS 致病相關(guān)的信號(hào)，增加了對(duì)22q11．2DS 致病機(jī)制研究的信息量。

22q11．2DS 的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，目前已經(jīng)報(bào)道的表型有180種之多。這些表型在各個(gè)患者的表現(xiàn)存在較大的個(gè)體差異。22q11．2DS 的臨床表現(xiàn)還有一定的時(shí)間差異性，即隨著個(gè)體的發(fā)育逐漸顯現(xiàn)出來［7］。該實(shí)驗(yàn)MLPA 檢測結(jié)果顯示22q11．21 區(qū)域196、208、371信號(hào)均降低，196信號(hào)相對(duì)應(yīng)的是CLDN5 基因，208 信號(hào)相對(duì)應(yīng)的是GP1BB 基因，371信號(hào)相對(duì)應(yīng)的是SNAP29 基因。研究資料［8］顯示，CLDN5 基因與眼部疾病有關(guān)。GP1BB 和SNAP29 基因是診斷22q11．2DS 的關(guān)鍵基因［9］，與先天性心臟畸形的發(fā)生有很大相關(guān)性［10-11］。通過MLPA 對(duì)22q11．2DS的檢測可為22q11．2DS 胎兒的心外畸形推測、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、治療方案選擇［12］等提供更多有用信息。

74%的22q11．2DS 患有先天性疾病，特別是圓錐動(dòng)脈干畸形［2］。有研究［13］認(rèn)為:先天性心臟病患者，無論是否合并有其他畸形或異常，均應(yīng)進(jìn)行22q11．2DS 的檢測。22q11．2DS 攜帶者，無論其臨床表現(xiàn)如何，其后代獲得這一染色體異常的幾率都是50%，并且后代有可能表現(xiàn)為嚴(yán)重的綜合征。因此及時(shí)、準(zhǔn)確地進(jìn)行產(chǎn)前診斷可以有效避免這種缺陷患兒的出生，尤其是對(duì)先天性心臟病高危妊娠的婦女。當(dāng)胎兒或患兒有相關(guān)缺失時(shí)，均應(yīng)對(duì)其父母進(jìn)行同樣的檢測，以便為其進(jìn)行再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)遺傳咨詢。該實(shí)驗(yàn)采用的MLPA 技術(shù)無論從技術(shù)操作還是從人力、物力上均可達(dá)到臨床檢測的要求。

綜上所述，與FISH 技術(shù)相比，MLPA 技術(shù)能夠及時(shí)、準(zhǔn)確診斷22q11．2DS，為其后續(xù)的治療和預(yù)后判斷提供了大量的信息。

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