干旱脅迫下兩種委陵菜葉綠體超微結(jié)構(gòu)及光合生理特性

郭 瑤，王 玲

(1.吉林建筑大學(xué) 城建學(xué)院，長春，130111;2.東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，哈爾濱150040)

近年來，在全球氣候變化背景下干旱頻繁發(fā)生且日趨嚴(yán)重，大部分國家和地區(qū)都不同程度地受到干旱威脅［1］，干旱脅迫已成為限制植物正常生長發(fā)育及生理代謝的關(guān)鍵因素。

委陵菜(Potentilla chinensis)和翻白委陵菜(P.discolor)是薔薇科委陵菜屬的多年生宿根草本植物。委陵菜屬植物種類較多，約300余種，大多分布在北半球的寒帶、溫帶以及高山地區(qū)，我國有80余種，全國各地均有，但主要生長在東北、西北和西南地區(qū)［2］。委陵菜屬植物葉為指狀或羽狀復(fù)葉，花黃色、白色或紅色，瘦果多數(shù)，莖直立、上升或匍匐［3］。該屬植物抗逆性較強(qiáng)，具有較好的抗旱、抗寒性，還有良好的涵養(yǎng)水源、保持水土及護(hù)坡作用，植株也具有一定的觀賞性，已陸續(xù)的應(yīng)用在城市園林綠化和景觀配置中，能夠起到獨(dú)特的綠化美化作用，并表現(xiàn)出了良好的適應(yīng)性。當(dāng)前，城市園林中所應(yīng)用的委陵菜屬植物種類并不多，還有大量的資源可以被開發(fā)利用，值得去研究并推廣應(yīng)用。目前對委陵菜屬植物的研究，主要集中在藥用價(jià)值、觀賞價(jià)值、花粉形態(tài)、抗旱性、引種馴化、資源開發(fā)利用、葉表皮形態(tài)等的研究［4－9］。本研究通過對不同水分脅迫程度下委陵菜和翻白委陵菜葉片超微結(jié)構(gòu)以及光合生理特性的變化進(jìn)行差異分析，為兩種植物適應(yīng)干旱環(huán)境能力強(qiáng)弱的綜合評價(jià)提供更多的參考數(shù)據(jù)，也為委陵菜屬植物抗旱性評價(jià)提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)及采集

試驗(yàn)在東北林業(yè)大學(xué)苗圃中進(jìn)行，播種、培養(yǎng)委陵菜和翻白委陵菜的一齡幼苗做為試驗(yàn)材料。兩種委陵菜的野生種子于2010年8月采集自大慶草原，并于2011年3月開始播種，之后將幼苗移栽至高12cm、口徑為9cm的花盆中，保證每盆栽植1株幼苗，基質(zhì)選用土和草炭比例為3∶1的草炭土，基質(zhì)量為距離盆口2cm左右。將植株置于同一室內(nèi)環(huán)境中，并保持良好的溫度、光照和通風(fēng)條件，采取一致的養(yǎng)護(hù)栽培管理。

1.2 試驗(yàn)處理及取樣

于2012年6月選取發(fā)育良好、長勢一致的植株進(jìn)行水分處理。設(shè)對照組和處理組，采用稱重法控制水分。對照組維持正常的土壤含水量，使其土壤含水量保持在35%～40%之間;處理組則持續(xù)30d停止供水，試驗(yàn)開始后每5d進(jìn)行一次取樣，測定各干旱脅迫階段土壤含水量、葉片含水量、葉綠素含量和光合生理因子。當(dāng)處理組土壤含水量在25%～30%(輕度干旱脅迫)、15%～20%(中度干旱脅迫)、5%～10%(重度干旱脅迫)時(shí)，進(jìn)行植物取樣，觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)，各試驗(yàn)時(shí)間節(jié)點(diǎn)取樣均要求重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤含水量的測定

每次測定時(shí)分別取對照組和處理組的原狀土樣，所取土樣為距離盆口0～6cm的土層，重量10g左右。測量方法采用稱重法，將土樣放入105℃的烘箱內(nèi)連續(xù)烘干8h，之后放入80℃的烘箱內(nèi)24h，計(jì)算土壤含水量，計(jì)算公式如下:

土壤含水量(%)=(濕土質(zhì)量－烘干后質(zhì)量)/烘干后質(zhì)量×100%

1.3.2 葉片相對含水量、葉綠素含量的測定

采用烘干稱重法［10］測定葉片含水量;葉綠素含量采用乙醇浸提法測定［11］。

1.3.3 葉片超顯微結(jié)構(gòu)樣品的制備

取兩組植株中部位相同、大小相近的葉片，用刀片切取靠近葉片中脈的部位制備試驗(yàn)樣品，樣品切成約為1 mm×1 mm的小塊，切下后迅速將其放入3%的戊二醛溶液中固定24 h以上，之后在磷酸緩沖液中漂洗20min并重復(fù)3次，于4℃條件下移至1%的鋨酸中固定4h，去離子水漂洗3次，每次20min;接下來一步是脫水，選用的脫水試劑是乙醇，最后用環(huán)氧樹脂812包埋。切片采用的超薄切片機(jī)型號(hào)為LKB－5型;經(jīng)過醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染后;采用H7650型透射電鏡觀察并照相［12］。

每一土壤含水量下，隨機(jī)選取15個(gè)視野，用面積表示測量葉綠體的大小，每個(gè)視野的測量重復(fù)3次，取其平均值。

葉綠體變化率=(對照下大小—重度脅迫下大小)/對照下大小×100%

1.3.4 光合作用相關(guān)生理指標(biāo)的測定

在天氣晴朗、無風(fēng)條件下的9:00－11:00期間，采用LI－6400便攜式光合測定儀測定葉片凈光合速率(Pn，μmol·m－2·s－1)、蒸騰速率(Tr，mmol·m－2·s－1)、氣孔導(dǎo)度(Gs，mol·m－2·s－1)、胞間 CO2濃度(Ci，μmol·mol－1)，并計(jì)算水分利用率(WUE=Pn/Tr，μmol/mmol)。每一土壤含水量下，選取大小相似、生長良好的4片葉子，以自然光為光源進(jìn)行測定，每次測量重復(fù)5次，并將測定的葉片做好標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下土壤含水量、葉片相對含水量和葉綠素含量的變化

2.1.1 干旱脅迫下土壤含水量的變化

從圖1可以看出，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，處理組的委陵菜和翻白委陵菜土壤含水量均呈現(xiàn)逐漸的減小的趨勢。脅迫第5d時(shí)兩種植物的土壤含水量均處于25%～30%之間，此時(shí)是輕度脅迫階段;脅迫進(jìn)入到第10～15d階段時(shí)，土壤含水量在15%～20%范圍內(nèi)，處于中度脅迫階段;當(dāng)脅迫進(jìn)入到第20～25d時(shí)，土壤含水量處在15%～20%之間，屬于重度脅迫階段。

圖1 干旱脅迫對土壤含水量的影響Fig.1 The impact of drought stress on water content of soil

2.1.2 干旱脅迫下葉片含水量的變化

逆境條件下植物葉片相對含水量可反映植物的保水能力，是標(biāo)志植物水分狀況的重要指標(biāo)［13］。由圖2可知，隨著水分脅迫天數(shù)的增加兩種植物的葉片含水量均呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，在脅迫的第5d～10d委陵菜下降的幅度最大，為21.53%;翻白委陵菜葉片含水量最大幅度的下降則出現(xiàn)在脅迫的第10d～15d，下降幅度為21.6%。脅迫末期時(shí)委陵菜和翻白委陵菜葉片含水量的下降幅度分別達(dá)到了78.8%、75.14%，委陵菜葉片含水量的下降幅度大于翻白委陵菜。

圖2 干旱脅迫對葉片含水量的影響Fig.2 The impact of drought stress on leaves relative water content

2.1.3 干旱脅迫下葉片葉綠素含量的變化

由圖3可知，兩種植物的葉綠素含量均隨著干旱脅迫的加重呈持續(xù)下降的趨勢。委陵菜和翻白委陵菜葉綠素含量最大幅度的下降分別出現(xiàn)在脅迫的第10d～15d和脅迫的第15d～20d。干旱脅迫30d后，同正常狀態(tài)相比委陵菜和翻白委陵菜葉綠素含量分別下降了56.9%、48.98%，表明受干旱脅迫后委陵菜葉綠素的含量低于翻白委陵菜。

圖3 干旱脅迫對葉片葉綠素含量的影響Fig.3 The impact of drought stress on Chlorophyll content

2.2 干旱脅迫下葉綠體超微結(jié)構(gòu)及大小的變化

正常供水條件下，委陵菜和翻白委陵菜的葉肉細(xì)胞形態(tài)和葉綠體超微結(jié)構(gòu)都基本一致。葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、發(fā)育正常，葉綠體數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)規(guī)則，大多呈長橢圓形，與細(xì)胞壁緊密結(jié)合并整齊單行排列。葉綠體內(nèi)片層清晰可見，排列整齊有序，方向與葉綠體長軸基本平行，基質(zhì)濃厚，可見淀粉粒和少量的嗜鋨顆粒(圖4－A，圖4－E)。此時(shí)，植物能夠進(jìn)行正常的光合作用。

輕度干旱脅迫時(shí)，部分葉綠體體積變大，漸漸向細(xì)胞中央移動(dòng)，不再與細(xì)胞壁緊貼，細(xì)胞壁厚度略有增加，少量類囊體片層結(jié)構(gòu)不再是整齊排列開始變得扭曲、膨脹，嗜鋨顆粒變多。委陵菜葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化的程度要比翻白委陵菜明顯(圖4－B，圖4－F)。

中度脅迫時(shí)，葉片細(xì)胞壁明顯增厚，大部分葉綠體開始膨脹，由正常狀態(tài)下的長橢圓形變成了球形，葉綠體脫離了細(xì)胞壁，出現(xiàn)了質(zhì)壁分離，外膜不再清晰。委陵菜葉綠體外膜局部出現(xiàn)了破裂，基粒片層排列松散、分辨不清且方向改變，類囊體變得腫脹，已有透明腔產(chǎn)生(圖4－C);翻白委陵菜的葉綠體結(jié)構(gòu)同樣出現(xiàn)了擴(kuò)張、分離、扭曲，但依然可以看到一些排列有序的片層結(jié)構(gòu)(圖4－G)。

重度脅迫時(shí)，委陵菜葉綠體形態(tài)變得不規(guī)則，邊緣粗糙，被膜破裂，內(nèi)含物外流，完全與質(zhì)膜分離，片層結(jié)構(gòu)排列紊亂，部分溶解，類囊體膜互相貼疊，嗜鋨顆粒膨大(圖4－D)。翻白委陵菜的葉綠體團(tuán)聚在一起，發(fā)生了粘連現(xiàn)象，膜結(jié)構(gòu)模糊不清，但少部分尚未破裂，基粒片層模糊不清，嗜鋨顆粒明顯增多(圖4－H)。

圖4 干旱脅迫對兩種委陵菜葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of drought stress on chloroplast in leaves of two Potentilla species

Ch，葉綠體;CW，細(xì)胞壁;GL，基粒;OG，嗜鋨顆粒

隨著干旱脅迫程度加重，葉綠體減小，且不同土壤含水量間差異顯著(P＜0.05)。委陵菜受重度干旱脅迫后葉綠體變化率為77.19%，而翻白委陵菜葉綠體的變化率為71.22%(表1，圖4)。

表1 干旱脅迫對兩種委陵菜葉綠體大小(μm2)的影響Tab 1 Effects of drought stress on chloroplast size of twoPotentilla species

2.3 干旱脅迫下各光合生理特性的變化

2.3.1 干旱脅迫下葉片凈光合速率、蒸騰速率和水分利用率的變化

水分脅迫會(huì)導(dǎo)致葉綠體光合機(jī)構(gòu)的破壞，引起光合CO2同化效率的降低，使葉片光合速率降低［14］。在整個(gè)干旱脅迫過程中兩種委陵菜屬植物對照組的凈光合速率(Pn)變化不大，且一直維持在較高的水平。處理組則從脅迫開始Pn便呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在脅迫的第10～15d期間委陵菜Pn下降幅度最大，此時(shí)正處于輕度到中度脅迫的過渡期;翻白委陵菜Pn大幅下降出現(xiàn)在脅迫的第15～20d，此時(shí)脅迫處于中度到重度的過渡期。委陵菜Pn的下降幅度要大于翻白委陵菜，且相同脅迫天數(shù)翻白委陵菜的Pn都要高于委陵菜(圖5)。

對照組的蒸騰速率(Tr)一直相對平穩(wěn)，保持在 5.7μmol·m－2·s－1至 6.4μmol·m－2·s－1之間;處理組隨著脅迫時(shí)間的延長，兩種委陵菜屬植物葉片的Tr則越來越小，Tr大幅度的下降均出現(xiàn)在脅迫的第10～15d期間，但脅迫過程中翻白委陵菜Tr的數(shù)值均高于委陵菜(圖5)。

水分利用效率(WUE)可以反映光合作用與蒸騰作用之間的關(guān)系，它提供了有關(guān)水分代謝功能的信息［15］。兩種植物對照組的WUE變化不大;處理組總體上呈先上升后下降的趨勢，委陵菜和翻白委陵菜WUE 的平均值分別為 1.46μmol·mmol－1和 1.49μmol·mmol－1，后者略高于前者(圖5)。

圖5 干旱脅迫對葉片凈光合速率、葉片蒸騰速率、水分利用率的影響Fig.5 Effect of drought stress on net photosynthetic rate，transpiration rate and WUE of leaf

2.3.2 干旱脅迫下葉片胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度的變化

兩種植物對照組的葉片胞間CO2濃度(Ci)變化幅度不大，比較穩(wěn)定。處理組中Ci的變化基本呈逐漸上升的趨勢，干旱脅迫的前10d委陵菜的Ci值同對照組差異不大，數(shù)值波動(dòng)也很小，第10d之后開始明顯上升;翻白委陵菜則是在脅迫15d后開始與對照組形成明顯的差異，Ci值表現(xiàn)出大幅的升高(圖6)。

隨著干旱脅迫的加劇，兩種委陵菜屬植物氣孔導(dǎo)度(Gs)總體表現(xiàn)為下降的趨勢，Gs的下降均在第15～20d期間表現(xiàn)得最為顯著，脅迫開始后委陵菜的Gs基本上都小于翻白委陵菜(圖6)。

圖6 干旱脅迫對葉片胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度的影響Fig.6 Effect of drought stress on Ci and stomata conductance of leaf

2.4 土壤含水量與各光合因子的相關(guān)性分析

由表2可見，土壤含水量同委陵菜和翻白委陵菜的Pn、Tr、Gs均呈極顯著正相關(guān)，同Ci呈極顯著負(fù)相關(guān)，其中同Pn的相關(guān)系數(shù)最大。說明土壤含水量與各光合因子間均存在一定的相關(guān)性，某一指標(biāo)的改變都會(huì)對其它因子產(chǎn)生一定的影響。

表2 兩種委陵菜土壤含水量與光合指標(biāo)間的相關(guān)性分析Tab 2 Correlation analysis between photosynthetic indexes and water

3 討論和結(jié)論

水分虧缺已經(jīng)成為限制植物生長最普遍的非生物因素之一［16］。植物體直接暴露在環(huán)境中面積最大的器官是葉片，因此，當(dāng)植物受到外界不良環(huán)境脅迫時(shí)，葉片最容易因適應(yīng)環(huán)境而改變其自身的形態(tài)和結(jié)構(gòu)［17－19］。在干旱脅迫下，植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生明顯的變化［20］，葉片細(xì)胞中葉綠體是對于干旱脅迫表現(xiàn)較為敏感并有著比較重要生理功能的細(xì)胞器。本研究對委陵菜和翻白委陵菜采取相同的干旱脅迫處理，通過葉片含水量、葉綠素含量、葉綠體大小變化率、葉綠體超微結(jié)構(gòu)以及光合生理指標(biāo)的變化來比較兩種植物耐旱能力的強(qiáng)弱。研究結(jié)果表明，兩種植物的抗旱能力為翻白委陵菜＞委陵菜。

葉片含水量可以反映植物體內(nèi)水分的狀況以及葉片的保水能力;葉綠素含量的高低在很大程度上反映了某種植物葉片光合作用的強(qiáng)弱，并在一定程度上可以作為衡量葉片衰老的指標(biāo)［21］。試驗(yàn)還測定了葉綠體大小的變化率，它可以作為判斷和比較植物抵抗外界不良環(huán)境能力的依據(jù)。郁慧［22］、白志英［23］、張金政［24］、宋家壯［25］、初曉輝［26］分別對干旱脅迫下不同植物葉綠體結(jié)構(gòu)受損程度、葉綠素含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明當(dāng)植物受到相同程度的干旱脅迫時(shí)，葉綠體被破壞的程度越嚴(yán)重，植物的抗旱能力越弱。本研究中，受干旱脅迫后委陵菜的葉片含水量、葉綠素含量均比翻白委陵菜低，但葉綠體的變化率卻比翻白委陵菜大，表明受相同程度干旱脅迫時(shí)委陵菜葉綠體的受損程度更為嚴(yán)重。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在光合作用中起著吸能和轉(zhuǎn)能的作用［27］。干旱脅迫條件下，氣孔導(dǎo)度與葉片蒸騰的強(qiáng)弱同步變化，隨著氣孔閉合數(shù)量的增加，植物的蒸騰作用相應(yīng)的受到了抑制，光合速率也隨之下降［28］。葉綠體基粒和基粒片層數(shù)越多，基粒片層排列越致密，光合能力越強(qiáng)［29］。當(dāng)葉綠體基粒片層和基質(zhì)片層受到外界環(huán)境脅迫而破壞解體甚至消失時(shí)，會(huì)抑制光合作用的正常進(jìn)行［28］。本研究表明，干旱脅迫開始后隨著土壤含水量的降低，葉綠體受損程度的加重，兩種植物的Pn、Tr和Gs均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，Ci則在脅迫初期時(shí)有所下降，之后便一直處于不斷升高的趨勢。光合作用受氣孔和非氣孔因素影響，委陵菜屬的這兩種植物受到輕度干旱脅迫時(shí)，Ci都下降了，說明此時(shí)造成光合速率下降的主要因素是氣孔關(guān)閉;隨著脅迫程度的加重，光合速率仍然在不斷的減小，但Ci卻開始升高，表明此時(shí)光合速率的下降受非氣孔因素的限制。光合速率的減弱有一個(gè)從氣孔限制向葉肉細(xì)胞光合活性限制轉(zhuǎn)變的過程，也就是由氣孔限制因素向非氣孔因素轉(zhuǎn)變的過程，表現(xiàn)為光合器官活性的下降［30］。WUE是反映植物光合特性和蒸騰特性的綜合指標(biāo)，用來說明植物消耗單位質(zhì)量的水分能夠固定CO2的數(shù)量［31］，WUE若下降說明Pn下降的幅度要大于Tr，若升高則說明Tr下降的幅度要大于Pn。土壤含水量和光合因子相關(guān)性分析表明了干旱對于植物光合性能的影響。通過分析比較受干旱脅迫后兩種委陵菜光合性能的變化發(fā)現(xiàn)，兩者光合生理指標(biāo)的變化趨勢基本一致，但脅迫天數(shù)相同時(shí)委陵菜葉綠體超微結(jié)構(gòu)和各光合指標(biāo)的變化基本都比翻白委陵菜顯著，各階段數(shù)值變化的幅度也基本大于翻白委陵菜，說明和翻白委陵菜相比委陵菜的抗旱能力相對較弱。

綜上所述，干旱脅迫條件相同時(shí)，對翻白委陵菜的影響要小于委陵菜，兩種植物均具有一定的抗旱能力，但委陵菜的抗旱能力比翻白委陵菜弱。葉片含水量、葉綠素含量、葉綠體超微結(jié)構(gòu)和光合生理指標(biāo)均可作為綜合評價(jià)不同委陵菜屬植物抗旱能力強(qiáng)弱的基礎(chǔ)參數(shù)，本研究結(jié)果可作為干旱地區(qū)綠化植物種類選擇的重要參考依據(jù)，還可為植物種類的抗旱性選育提供生理方面以及細(xì)胞學(xué)方面的資料。

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