張鵬 弓瑞娟

（山西省畜牧遺傳育種中心030027）

甘油稀釋濃度對牛凍精活率的影響

張鵬 弓瑞娟

（山西省畜牧遺傳育種中心030027）

研究不同濃度的甘油對牛精液在冷凍后的活率，觀察到甘油在牛冷凍精液稀釋液的添加濃度為4%時(shí)，不但足以保護(hù)精子細(xì)胞，而且可以在冷凍過程中將損害降到最小，表明4%的甘油濃度對牛精子冷凍的效果最好。

牛精子；甘油濃度；精子活率；精子頂體完整率

近年來我國種公牛站在配制牛冷凍精液的稀釋液時(shí)所采用的防凍保護(hù)劑大多為甘油，本文通過不同濃度的甘油對牛冷凍精液在冷凍后活率的影響試驗(yàn)，探討不同濃度甘油對牛精子在冷凍過程中的影響，從而篩選出有利于牛精子冷凍的最佳甘油濃度。

甘油的分子量為92.09，結(jié)構(gòu)簡式為CH2OHCHOHCH2OH，甘油的理化特性具有溶于水不易發(fā)生結(jié)晶、吸水性強(qiáng)和可降低水溶液冰點(diǎn)的特點(diǎn)；當(dāng)牛精液冷凍時(shí)，主要受到的危害是冰晶從精細(xì)胞原生質(zhì)中抽去水，使精細(xì)胞造成脫水狀態(tài)，發(fā)生不可逆的變化死亡，而甘油可以減少和降低這種對精細(xì)胞的損害作用。

1 材料與方法

1.1 牛冷凍精液稀釋液配方

用電子天平準(zhǔn)確稱量配制稀釋液所需的藥品，所用藥品為分析純。

配方Ⅰ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、0%甘油

配方Ⅱ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、2%甘油

配方Ⅲ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、3%甘油

配方Ⅳ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、4%甘油

配方Ⅴ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、5%甘油

配方Ⅵ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、6%甘油

以上6種配方均滅菌后加入相同量的卵黃和相同量的抗菌素。

1.2 試驗(yàn)方法

選出山西省畜牧遺傳育種中心正常參加采精的荷斯坦種公牛10頭進(jìn)行采精，采得精液后先對精液進(jìn)行質(zhì)檢，各項(xiàng)指標(biāo)合格且活率均在0.6以上者方可用于本次試驗(yàn)。將經(jīng)過初步檢測的牛精液分別用以上6種稀釋液并根據(jù)牛精液品質(zhì)的不同，按照有效精子數(shù)300～500萬/劑進(jìn)行稀釋后分裝入0.25ml細(xì)管。將這些牛精液細(xì)管按照不同的甘油濃度分成6組放入4℃恒溫冰箱平衡3～4h后放入全自動(dòng)冷凍儀進(jìn)行冷凍。經(jīng)過7min的冷凍后迅速取出放入液氮中保存。將冷凍好的牛精液按照每組每頭牛抽取10支的方法依照標(biāo)準(zhǔn)解凍，要求解凍后進(jìn)行活率檢測（用細(xì)管中1/2的精液量）并記錄結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行精子頂體完整率的檢測 （用活率檢測后細(xì)管中剩余的1/2精液）并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

這次試驗(yàn)采用次級樣本含量相等的系統(tǒng)分組分析方法進(jìn)行方差分析，并且進(jìn)行F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

通過分析試驗(yàn)結(jié)果可以得出：不同甘油濃度對牛精液冷凍后活率的影響差異極顯著 （P＞0.01）， 甘油濃度為4%顯著高于5%和6%，極顯著高于0%、2%和3%；5%極顯著高于3%，6%顯著高于3%，5%和6%極顯著高于0%和2%，5%顯著高于6%；3%顯著高于2%，2%和3%極顯著高于0%。而甘油濃度相同的牛凍精之間的活率差異均不顯著 （P＞0.05）， 見表1。

表1 6種不同甘油濃度的精子凍后平均活率比較 （SSR法）

不同甘油濃度對牛精液冷凍后精子頂體完整率的影響差異極顯著 （P＞0.01），甘油濃度為4%顯著高于3%和5%，極顯著高于0%、2%和6%；3%與5%顯著高于2%和6%，極顯著高于0%，3%顯著高于5%；2%顯著高于6%，2%和6%極顯著高于0%。而甘油濃度相同的牛凍精之間的頂體完整率差異均不顯著 （P＞0.05）， 見表2。

3 討論

3.1 甘油對牛精液冷凍時(shí)的保護(hù)作用

（1）甘油沖淡溶液中溶質(zhì)的濃度。甘油可以進(jìn)入精細(xì)胞內(nèi)代替細(xì)胞內(nèi)部分游離水，使游離水連同無機(jī)鹽被排出，降低了細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，從而在冷凍時(shí)可阻止在-15℃以下引起精子細(xì)胞蛋白質(zhì)變性。

（2）甘油降低了稀釋后精液的冰點(diǎn)，使精液處于過冷狀態(tài)，因此在-15℃以下才結(jié)冰，減緩了細(xì)胞的皺縮程度和脫水速度。

（3）減少在形成冰晶時(shí)滲入細(xì)胞內(nèi)鹽類的數(shù)量。

（4）甘油可以通過細(xì)胞膜，在解凍中可以保護(hù)精子。

（5）甘油可以保護(hù)精子細(xì)胞內(nèi)一部分酶免受凍害而逸出 （GOT）。

表2 6種不同甘油濃度的精子凍后頂體完整率比較 （SSR法）

3.2 甘油濃度對牛精液冷凍后活率影響

試驗(yàn)結(jié)果表明4%的甘油濃度對牛精液冷凍后活率最好，4%的甘油濃度最適宜保護(hù)精子的頂體完整。說明4%的甘油濃度可以最好的保護(hù)精子細(xì)胞，并且能夠?qū)p害作用降到最低。雖然甘油濃度＜4%時(shí) （2%、3%）對精子的損害程度要好于甘油濃度＞4%時(shí) （5%、6%），但是甘油濃度＜4%時(shí) （2%、3%）對精子細(xì)胞冷凍時(shí)的保護(hù)效果要差于甘油濃度＞4%時(shí) （5%、6%）。

3.3 試驗(yàn)結(jié)論

發(fā)現(xiàn)甘油濃度過低就不能形成對精子細(xì)胞的保護(hù)，使得精子遭受冷打擊造成精子冷休克和死亡；而甘油濃度過高，容易產(chǎn)生滲透損傷或?qū)釉斐啥竞ψ饔檬咕勇灾卸荆驗(yàn)楦视蜐舛冗^高使得稀釋液中滲透壓明顯升高，這種高滲透壓導(dǎo)致精子頂體破損比例升高，精子細(xì)胞中GOT酶泄出量增加。本試驗(yàn)證明甘油在牛冷凍精液稀釋液的添加濃度為4%時(shí)，不但足以保護(hù)精子細(xì)胞，而且可以在冷凍過程中將損害降到最小，表明4%的甘油濃度對牛精子冷凍的效果最好。