呂剛 ，魏林 ，梁志懷 ，張屹

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所）

蓮藕是我國(guó)的一種特色水生蔬菜，在我國(guó)已有3 000多a的栽培歷史。目前在我國(guó)很多地區(qū)，蓮藕栽培已成為農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的重要方式。近年在整個(gè)蓮藕生長(zhǎng)過(guò)程中，各類(lèi)葉斑病病害發(fā)生日益嚴(yán)重，一定程度上制約了蓮藕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中發(fā)生最為普遍的就是由半知菌亞門(mén)鏈格孢屬（Alternaria）真菌引起的蓮藕黑斑病或稱蓮藕褐紋病[1]。該病典型癥狀是在蓮葉上產(chǎn)生黑褐色病斑，發(fā)病后期病斑可連成一片，造成整片葉枯死，給蓮藕的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來(lái)重大影響。

目前，在防治蓮藕葉斑病上，登記的藥劑僅有丙環(huán)唑及多菌靈2種，單一使用某種或某幾種藥劑，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，更加不利于田間防治。本文通過(guò)對(duì)分離、純化獲得的目標(biāo)病原菌進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，篩選出毒力較強(qiáng)的藥劑，并將獲得的藥劑在蓮藕栽種田進(jìn)行大田防治試驗(yàn)，以期獲得對(duì)蓮藕鏈格孢葉斑病具有較好防效的化學(xué)藥劑。

1 材料與方法

1.1 病葉的采集及目標(biāo)病原菌的獲得

鏈格孢葉斑病典型病葉采集于湖南長(zhǎng)沙縣黃興鎮(zhèn)子蓮種植區(qū)，品種為寸三蓮。病原菌的分離采用組織分離法，待分離組織塊在PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌絲后，挑取菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后再對(duì)純化培養(yǎng)菌株進(jìn)行單孢分離純化，獲得純培養(yǎng)物[2]。

1.2 病原菌形態(tài)觀察

將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7 d后觀察菌落形狀、顏色及菌絲疏密程度，并在顯微鏡下觀察其分生孢子形態(tài)并拍照保存，同時(shí)測(cè)量分生孢子的大小。根據(jù)分生孢子形態(tài)和大小，參照魏景超[4]的方法，初步確定病原屬種（關(guān)于具體種的確定另文發(fā)表）。

1.3 分離物致病性測(cè)定及再分離

根據(jù)柯赫氏法則，采用活體接種法，先將待接種的健康幼嫩、無(wú)斑點(diǎn)和褪綠癥狀的盆栽蓮藕葉片接種部位進(jìn)行表面消毒，然后將分離純化的病原菌菌絲塊以針刺法接種于該部位，并用蘸水的無(wú)菌脫脂棉保濕。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，并以無(wú)菌PDA培養(yǎng)基接種作為對(duì)照，待接種部位出現(xiàn)葉斑癥狀后，從癥狀病健交界處再次進(jìn)行病原菌分離[3]。

1.4 供試化學(xué)藥劑對(duì)鏈格孢菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

供試的化學(xué)藥劑及使用濃度見(jiàn)表1。

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定[5]，比較供試化學(xué)殺菌劑藥劑對(duì)葉斑病病原菌的室內(nèi)毒力。用無(wú)菌水將各藥劑配制成10 mg/mL的母液，再根據(jù)前期預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，取定量的母液加入溫度40～50℃的無(wú)菌PDA三角瓶中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，制成含不同供試濃度殺菌劑的平板備用。在平板中央接種一塊病原菌的菌餅，置于25℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不含藥劑的PDA平板為對(duì)照，各供試濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)。待對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)定各培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的直徑。

抑菌率（I，%）=[（D0-Dt）/D0]×100%，其中：I為菌絲生長(zhǎng)抑制率，D0為對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑，Dt為處理菌落增長(zhǎng)直徑。其中D=D1-D2（D表示菌落增長(zhǎng)直徑，D1表示菌落直徑，D2表示菌餅直徑）。

以藥劑濃度的對(duì)數(shù)為自變量X，以抑制率的機(jī)率值為因變量Y，運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求出供試藥劑對(duì)病菌的毒力回歸方程Y=aX+b及相關(guān)系數(shù)（r）值，并由方程計(jì)算各供試藥劑的抑制中濃度（EC50）。

表1 供試化學(xué)藥劑及室內(nèi)毒力測(cè)定使用濃度

1.5 大田試驗(yàn)

①施藥方法 根據(jù)室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，參照田間實(shí)際用藥情況，選取田間防治黑斑病的藥劑及使用濃度分別為50%多菌靈可濕性粉劑500倍液、40%氟硅唑乳油8 000倍液、25%丙環(huán)唑乳油3 000倍液和99%噁霉靈原藥4 000倍液。大田防治試驗(yàn)在湖南懷化洪江藕蓮種植基地進(jìn)行，該地藕田土壤肥力中等，各試驗(yàn)藥劑小區(qū)面積約300 m2。施藥時(shí)為藕蓮生長(zhǎng)的立葉期，此時(shí)田中黑斑病已普遍發(fā)生。施藥液量為40 kg/667 m2，以等量清水作為對(duì)照。共施藥3次，每次間隔7 d。第1次施藥前和最后1次施藥后7 d調(diào)查病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算各藥劑的防治效果。

②調(diào)查方法與防效計(jì)算 采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣調(diào)查法，每點(diǎn)選取20～30片葉調(diào)查病情。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：病斑面積占整片葉面積的10%及以下；3級(jí)：病斑面積占整片葉面積的11%～25%；5級(jí)：病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7級(jí)：病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9級(jí)：病斑面積占整片葉面積的75%及以上。按下面公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[6]，病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100；防治效果（%）=[1-（CK0×Pt1）/（CK1×Pt0）]×100%； 其中 CK0為藥前對(duì)照組病情指數(shù)，CK1藥后對(duì)照組病情指數(shù)，Pt0為藥前處理組病情指數(shù)，Pt1藥后處理組病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢屬病原菌的獲得

初始菌株和再分離菌株在PDA上培養(yǎng)7 d后，菌落正面呈顏色均一的黑色，表面呈細(xì)茸狀，菌落背面略呈褐色，表面光滑（圖1、2）。顯微觀察表明，分生孢子褐色，呈倒棍棒狀，頂端延長(zhǎng)，多細(xì)胞，有壁磚狀分隔（圖3、4）。

2.2 病原菌毒力測(cè)定

從表2中的EC50值可知，各藥劑對(duì)該病原菌的菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其中40%氟硅唑乳油的抑菌效果最好，其EC50值為0.42 μg/mL，而25%醚菌酯懸浮劑的抑菌效果最低，其EC50值高達(dá)500.00 μg/mL。

2.3 大田試驗(yàn)

選用室內(nèi)對(duì)蓮藕黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)抑制力較強(qiáng)的3個(gè)化學(xué)農(nóng)藥（多菌靈、氟硅唑和噁霉靈）以及在蓮藕上已經(jīng)登記的藥劑丙環(huán)唑，對(duì)黑斑病進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，應(yīng)用防效見(jiàn)表3。

圖1 鏈格孢屬病原菌的獲得與孢子形態(tài)

試驗(yàn)結(jié)果表明，在田間黑斑病普遍發(fā)生的情況下，40%氟硅唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑對(duì)該病具有較好的防治效果，防效都達(dá)70%以上，25%丙環(huán)唑乳油的防效為62.67%，低于前兩者；而以前在蓮藕浮葉期撒施對(duì)黑斑病預(yù)防效果較好的99%噁霉靈原藥對(duì)該病的治療效果僅有46.19%。

表2 供試藥劑對(duì)黑斑病菌室內(nèi)毒力生測(cè)結(jié)果

表3 各藥劑大田試驗(yàn)防治效果

3 討論與結(jié)論

交鏈孢屬真菌是一類(lèi)常見(jiàn)的病原菌，可侵染葉片，引起植物各類(lèi)葉斑病，如玉米交鏈孢葉枯病、棉花黑斑病、辣椒黑斑病等[7～9]。本試驗(yàn)利用從藕田分離得到的交鏈孢病原菌菌株，進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定和大田試驗(yàn)，篩選得到了對(duì)該菌株有較強(qiáng)毒力和良好田間防治效果的化學(xué)藥劑40%氟硅唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑。氟硅唑是一種三唑類(lèi)的內(nèi)吸殺菌劑，具有保護(hù)和治療作用，滲透性強(qiáng)，是當(dāng)前防治真菌性葉斑病的主要藥劑；而多菌靈作為一種廣譜高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，既是市場(chǎng)上廣泛使用的藥劑也是蓮藕上登記的藥劑，2個(gè)藥劑均容易獲得。二者與在蓮藕上另一登記藥劑——25%丙環(huán)唑乳油交替使用，防治蓮藕黑斑病，可以避免該病原菌產(chǎn)生抗藥性。前期試驗(yàn)表明，99%噁霉靈原藥在對(duì)藕種浸種處理、浮葉期撒施土壤處理時(shí)對(duì)黑斑病均具有較好的預(yù)防效果，但在黑斑病發(fā)生較嚴(yán)重中，用該藥劑噴霧處理對(duì)黑斑病的治療效果卻并不理想。該試驗(yàn)結(jié)果為藕農(nóng)田間施藥防治黑斑病提供更多了選擇和指導(dǎo)。

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