王 晗，米生權(quán)，孫雅煊，趙 卓，林 強(qiáng)

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191）

殼寡糖對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

王 晗，米生權(quán)，孫雅煊，趙 卓*，林 強(qiáng)

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191）

目的：探討不同質(zhì)量濃度的殼寡糖延長秀麗隱桿線蟲壽命的活性功能，試圖尋求延緩衰老的生物活性物質(zhì)。方法：以秀麗隱桿線蟲為模式生物，以線蟲壽命為指標(biāo)，用相對分子質(zhì)量≤1 000的殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）設(shè)立對照組和殼寡糖4 個用藥組（50、100、200、400 mg/L），測定線蟲的壽命、生殖能力、移動速率和吞咽頻率。結(jié)果：與對照組比較，殼寡糖質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L以上時可使線蟲的壽命延長（P＜0.05），不同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲平均壽命和最大壽命均具有延長作用。殼寡糖400 mg/L組延長壽命的效果最為明顯。與對照組比較，殼寡糖質(zhì)量濃度在100 mg/L以上時線蟲的移動速率和吞咽頻率增加（P＜0.01），但當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度為400 mg/L時，線蟲的移動速率和吞咽頻率的增加幅度趨緩。結(jié)論：相對分子質(zhì)量≤1 000的殼寡糖在50～400 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能夠延長秀麗隱桿線蟲的壽命。

秀麗隱桿線蟲；模式生物；壽命；殼寡糖；抗衰老

從海洋生物中提取的殼聚糖具有多種生物活性，可以作為一種具有生物相容性和生物降解性的新型生物材料[1]，其水解產(chǎn)物殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）不但有分子質(zhì)量小，毒性低、水溶性好等特點(diǎn)，還起到增加人體免疫力、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血脂和血壓等功能[2]，同時還具有抗氧化[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抗菌[7]、抗感染[8]等多種藥理作用，對細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧自由基具有一定的清除作用，同時對細(xì)胞接受外界刺激產(chǎn)生的氧化應(yīng)激也能夠起到一定的保護(hù)作用[9-10]。盡管有研究表明，殼寡糖相關(guān)產(chǎn)品功能聲稱具有延緩衰老的特性，但很少有直接的證據(jù)支持殼寡糖能夠延長壽命。自1995年至今，在中國期刊網(wǎng)上僅有4 篇文獻(xiàn)以壽命為研究終點(diǎn)，明確指出殼寡糖具有延緩衰老的作用，其中1 篇為含有殼寡糖等多種成分產(chǎn)品的抗衰老研究（大豆異黃酮-殼聚糖-海藻酸鈉緩釋微囊的抗衰老能力的實(shí)驗(yàn)研究），用殼聚糖-海藻酸鈉包埋體系制備大豆異黃酮緩釋微囊，評價緩釋微囊的抗衰老效應(yīng)[11]。其余3 篇文章分別用小鼠和果蠅作為實(shí)驗(yàn)對象，研究了殼寡糖的抗衰老作用，但壽命的終點(diǎn)研究均以果蠅為實(shí)驗(yàn)對象[12-14]。本研究選用國際上公認(rèn)的在延緩衰老研究領(lǐng)域中具有優(yōu)勢的主要模式生物秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱線蟲）作為研究對象，以整體動物壽命實(shí)驗(yàn)作為檢測手段[15]，以線蟲的平均壽命、生殖能力、移動速率和吞咽頻率作為切入點(diǎn)，研究不同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲壽命的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

菌株E. coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲Bristol（N2）由北京生命科學(xué)研究所惠贈。

殼寡糖（相對分子質(zhì)量≤1 000，可溶于水）由大連中科格萊克生物技術(shù)有限公司惠贈；5-氟尿嘧啶 美國Sigma公司；瓊脂粉 日本協(xié)和株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-250F-II霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；S6E體視顯微鏡 德國Leica公司；5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 線蟲培養(yǎng)

線蟲的培養(yǎng)使用線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（NGM）[16]，配制方法：每1 000 mL培養(yǎng)基含有瓊脂18～25 g，牛肉蛋白胨2.7 g，Tris-base 0.55 g，Tris-HCl 0.27 g，NaCl 2 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。給線蟲飼喂E. coli OP50，培養(yǎng)溫度為20 ℃。

1.3.2 線蟲同步化

用無菌水把成年的秀麗隱桿線蟲從NGM平板上沖洗至無菌的離心管中，1 200 r/min離心2 min，棄上清液，加入5 mL裂解液（每100 mL水中含有0.5 mol/L氫氧化鉀溶液10 mL，10%次氯酸鈉溶液10 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫下充分振蕩溶液5 min直到線蟲破開，以M9緩沖液清洗蟲卵3 次。用M9緩沖液懸浮離心管底部蟲卵，滴在鋪有E. coli OP50的NGM平板上，于20 ℃培養(yǎng)箱中恒溫倒置培養(yǎng)約48 h，當(dāng)受精卵發(fā)育為L4期幼蟲時用于壽命測定實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 線蟲壽命測定

配制線蟲壽命測定生長培養(yǎng)基NGM，對照組培養(yǎng)基中含有無菌去離子水，受試組培養(yǎng)基中殼寡糖的終質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400 mg/L，每個質(zhì)量濃度設(shè)兩個平行。室溫放置過夜，將在37 ℃條件下培養(yǎng)16 h的E. coli OP50巴氏消毒法處理之后涂在測試用的NGM平板上，隨機(jī)挑取25 條同步化后的L4期幼蟲到各組NGM培養(yǎng)基上，于20 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)移時刻起開始計(jì)算線蟲的存活天數(shù)，轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)的第0天，每2～3 d記錄線蟲存活數(shù)量，并將存活線蟲轉(zhuǎn)移至新鋪好的含有E. coli OP50菌液和相同質(zhì)量濃度殼寡糖的NGM培養(yǎng)基上，實(shí)驗(yàn)持續(xù)至最后一條線蟲死亡為止，以鉑金絲碰觸線蟲仍然不動即判定為死亡。依據(jù)線蟲生存、死亡的條數(shù)繪制生存曲線。

1.3.4 生殖能力測定

隨機(jī)挑取25 條同步化后的L4期幼蟲至殼寡糖終質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400 mg/L的NGM培養(yǎng)基上，同時設(shè)空白對照組，每組2 個平行。每48 h把線蟲轉(zhuǎn)移至新鋪含有E. coli OP50菌液和相同質(zhì)量濃度殼寡糖的NGM培養(yǎng)基上，換下的舊板倒置于20 ℃培養(yǎng)24 h，記錄幼蟲數(shù)量，直到線蟲生殖能力喪失。將每天產(chǎn)生的子代數(shù)目相加即為線蟲終身產(chǎn)卵量。

1.3.5 移動速率測定

隨機(jī)挑取10 條同步化后的L4期幼蟲至殼寡糖終質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400 mg/L的NGM培養(yǎng)基上，同時設(shè)對照組，每組2 個平行。測定其移動速率，觀察時將線蟲挑至沒有食物的NGM平板上，先讓線蟲自由運(yùn)動2 min，在顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)，作為身體彎曲頻率的指標(biāo)。1 次彎曲定義為線蟲相對于身體長軸方向上的一個波長移動。

1.3.6 吞咽頻率測定

隨機(jī)挑取10 條同步化后的L4期幼蟲至殼寡糖終質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400 mg/L的NGM培養(yǎng)基上，同時設(shè)對照組，每組2 個平行。觀測其吞咽頻率，在顯微鏡下觀察并記錄1 min內(nèi)線蟲的吞咽次數(shù)，作為線蟲吞咽頻率的指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對線蟲壽命的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier法的生存分析，對線蟲壽命相關(guān)生理指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，相關(guān)性采用Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對線蟲壽命的影響

表1 不同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲壽命的影響Table 1 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the lifespan of C. elegans

圖1 不 同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲壽命的影響Fig.1 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the lifespan of C. elegans

經(jīng)Kaplan-Meier生存分析得出（表1），對照組線蟲的平均壽命為32.2 d， 最大壽命為32 d；殼寡糖400 mg/L組線蟲的平均壽命和最大壽命最長。與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。線蟲的生存曲線如圖1所示，與對照組相比，50、100、200、400 mg/L殼寡糖均能使線蟲的生存曲線右移并延長線蟲的平均壽命，以殼寡糖400 mg/L組最為顯著。根據(jù)Spearman相關(guān)分析得出，殼寡糖50、100、200、400 mg/L組延緩線蟲衰老作用具有一定的劑量依賴性（P＜0.05），本實(shí)驗(yàn)中400 mg/L組效果優(yōu)于其他劑量組。

2.2 殼寡糖對線蟲生殖能力的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲生殖能力的影響Fig.2 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the reproductive capacity of C. elegans

經(jīng)One-Way ANOVA分析得出，對照組線蟲平均產(chǎn)卵200 枚；殼寡糖50、100、200、400 mg/L組線蟲平均產(chǎn)卵分別為203、207、218、229 枚，與對照組相比，殼寡糖50、100、200、400 mg/L組的平均產(chǎn)卵數(shù)略高于對照組。如圖2所示，對照組線蟲的平均產(chǎn)卵量最少，殼寡糖400 mg/L組線蟲的平均產(chǎn)卵量最多。與對照組相比，殼寡糖各劑量組對線蟲的生殖能力均有影響，但影響程度不大。同時在顯微鏡下觀察到，高質(zhì)量濃度殼寡糖組線蟲體內(nèi)卵數(shù)量明顯增多，最后死亡時仍有大量卵未排出體外，而對照組卻無此現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.3 殼寡糖對線蟲移動能力的影響

經(jīng)One-Way ANOVA分析得出，對照組線蟲在1 min內(nèi)的平均移動距離是4.8；殼寡糖50、100、200、400 mg/L組線蟲的平均移動距離分別為5.2、5.3、5.4、5.3，殼寡糖100、200、400 mg/L組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。如圖3所示，1 min內(nèi)對照組線蟲的平均移動距離最短，殼寡糖200 mg/L組線蟲的平均移動距離最長。與對照組相比，殼寡糖各劑量組對線蟲的移動能力均有影響，在50～200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能提高線蟲的移動速率，但與200 mg/L組相比，400 mg/L的殼寡糖反而會導(dǎo)致線蟲的移動速率降低。

圖3 不同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲移動速率的影響Fig.3 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the movement speed of C. elegans

2.4 殼寡糖對線蟲吞咽頻率的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲吞咽頻率的影響Fig.4 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the swallowing frequency of C. elegans

經(jīng)One-Way ANOVA分析得出，對照組線蟲在1 min內(nèi)的吞咽頻率是80.9；殼寡糖50、100、200、400 mg/L組線蟲的平均吞咽頻率分別為83.0、84.3、85.6、82.5，殼寡糖50、100、200 mg/L組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。如圖4所示，1 min內(nèi)對照組線蟲的吞咽頻率最低，殼寡糖200 mg/L組線蟲的吞咽頻率最高。與對照組相比，殼寡糖各劑量組對線蟲的吞咽頻率均有影響，50～200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能提高線蟲的吞咽頻率，但與200 mg/L組相比，400 mg/L的殼寡糖會導(dǎo)致線蟲的吞咽頻率降低。

3 討 論

由于產(chǎn)卵數(shù)主要反映了秀麗線蟲的繁殖能力。因此，測定產(chǎn)卵數(shù)可以幫助研究殼寡糖對秀麗線蟲在繁殖能力方面所形成的延長壽命作用。移動速率和吞咽頻率是秀麗線蟲最基本的運(yùn)動。運(yùn)動行為常被作為反映神經(jīng)系統(tǒng)基本功能的指標(biāo)，也可以間接反應(yīng)出線蟲壽命及生存狀態(tài)，檢測以上指標(biāo)，操作和觀察較方便、實(shí)驗(yàn)周期較短、實(shí)驗(yàn)成本也較低[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼寡糖一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可延緩秀麗線蟲衰老，使用不同劑量的殼寡糖（50、100、200、400 mg/L）干預(yù)秀麗線蟲的衰老，結(jié)果表明在壽命方面，隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，線蟲的平均壽命顯著延長，具有一定的促生殖峰期作用，其中400 mg/L的殼寡糖作用效果優(yōu)于其他劑量。在生殖能力方面，隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，線蟲的產(chǎn)卵量有一定程度的增加，但卵排出體外過程有受阻現(xiàn)象，對終身排卵數(shù)的影響不大，但實(shí)際產(chǎn)卵數(shù)明顯提高，并且在殼寡糖組均出現(xiàn)了線蟲體內(nèi)有大量卵細(xì)胞滯留、生殖孔處膨出體外的現(xiàn)象，這可能是造成最后整體排卵數(shù)區(qū)別不大的原因。在移動能力和吞咽能力方面，殼寡糖在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能提高線蟲的移動速率和吞咽頻率，當(dāng)殼寡糖的質(zhì)量濃度超出一定范圍時，線蟲的移動速率和吞咽頻率又會有不同程度的下降，這可能是由于高質(zhì)量濃度的殼寡糖會對線蟲機(jī)體產(chǎn)生一定的毒性作用，線蟲通過降低運(yùn)動頻率來減少對有毒物質(zhì)的吸收，從而保障其基本生存能力。

在壽命方面，有研究人員用川芎提取物[18]、白藜蘆醇[19]、青蒿素[20]、淫羊藿總黃酮[21]、香椿葉總黃酮[22]、大鯢粗提物[23]、百草枯[24]等藥物對線蟲壽命方面作了相關(guān)研究。在抗氧化方面，有研究人員以小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象研究殼寡糖的抗氧化作用，證明殼寡糖在小鼠體內(nèi)能顯著降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，M D A）的含量，提高肝組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力[25]；在體外可以清除超氧陰離子自由基及羥自由基，具有清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化的作用，是一種天然抗氧化劑[26]。通過采用電子自旋共振技術(shù)就殼寡糖對超氧陰離子自由基的抑制作用進(jìn)行考察，證明不同分子質(zhì)量的殼寡糖具有明顯的清除自由基，抑制其活性的效果[27]，這種抑制作用很可能與分子鏈中大量的活性羥基有關(guān)。不同分子質(zhì)量的殼寡糖性質(zhì)差異很大，有時甚至表現(xiàn)出截然相反的特性，因而在清除自由基的活性方面也就存在很大差異[28-29]，清除自由基的活性隨殼寡糖分子質(zhì)量的減小而增強(qiáng)[30]，特別是低分子質(zhì)量的殼寡糖表現(xiàn)出較高的清除自由基活性[31]。這為殼寡糖及其金屬配合物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究低分子質(zhì)量殼寡糖的抗自由基活性研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而在分子水平上的一個方面揭示了殼寡糖作為醫(yī)用保健品的機(jī)理[32]。本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，以壽命作為研究指標(biāo)，觀察殼寡糖對線蟲壽命的影響，發(fā)現(xiàn)多個質(zhì)量濃度的殼寡糖對線蟲均有延長壽命作用或延長壽命趨勢，迄今為止還未見到有關(guān)殼寡糖這一藥理作用的報道。

由于殼寡糖的分子質(zhì)量與其生物活性有密切關(guān)系，低分子質(zhì)量殼寡糖含有大量的羥基和氨基，具有較好的水溶性和抗氧化活性，與同劑量的高分子質(zhì)量殼寡糖相比，低分子質(zhì)量殼寡糖顯示了更優(yōu)的活性功能[33]。且目前對殼寡糖抗氧化活性的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，相對分子質(zhì)量主要集中在10 000以下，以3 000以下活性最好[34-35]。由于之前研究了寡聚糖1 000 mg/L以下線蟲的存活率，通過對LC50的測定，發(fā)現(xiàn)殼寡糖質(zhì)量濃度≤500 mg/L時對線蟲的存活沒有影響，此外，其他用寡聚糖做細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的適宜質(zhì)量濃度范圍為50～125 mg/L[36]。因此本次實(shí)驗(yàn)使用相對分子質(zhì)量≤1 000的殼寡糖，研究殼寡糖活性與其在50～400 mg/L質(zhì)量濃度范圍之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量≤1 000的殼寡糖在50～400 mg/L范圍內(nèi)具有一定延長線蟲壽命的功能，其機(jī)制可能與抗自由基的活性有關(guān)，但殼寡糖活性與相對分子質(zhì)量之間的關(guān)系及其活性機(jī)制，以及高于400 mg/L的殼寡糖對線蟲壽命的影響等還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Chitooligosaccharides on Lifespan of Caenorhabditis elegans

WANG Han, MI Shengquan, SUN Yaxuan, ZHAO Zhuo*, LIN Qiang
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To explore the lifespan-prolonging effect of chitooligosaccharides (COS) at various concentrations on Caenorhabditis elegans (C. elegans) in order for these compounds to be developed into anti-aging drugs. Methods: C. elegans as a model organism were cultured in the absence (control) or presence of different concentrations (50, 100, 200 and 400 mg/L) of COS with a relative molecular mass not greater than 1 000. The effects of COS on the li fespan, reproductive capacity, movement speed and swallowing frequency of C. elegans were examined. Results: Compared with the control group, the lifespan of C. elegans was prolonged by COS at concentrations larger than 200 mg/L (P < 0.05). COS at all investigated concentrations could signifi cantly extend the mean and maximum lifespan of C. elegans and 400 mg/L was the most effective concentration for prolonging the lifespan of C. elegans. Compared with the control group, the movement speed and swallowing frequency of C. elegans were increased when the concentration of COS was higher than 100 mg/L (P < 0.01), reaching a plateau at 400 mg/L. Conclusion: COS with relative molecular mass equal to or less than 1 000 at concentrations of 50–400 mg/L can signifi cantly improve the mean and maximum lifespan of C. elegans.

Caenorhabditis elegans; model organism; lifespan; chitooligosaccharides; anti-aging

R114

A

1002-6630（2015）01-0229-05

10.7506/spkx1002-6630-201501044

2014-10-10

北京市教育委員會科學(xué)研究項(xiàng)目（SQKM201311417014）；北京市屬市管高等學(xué)校人才強(qiáng)教計(jì)劃項(xiàng)目（PHR201107150）

王晗（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称范纠韺W(xué)。E-mail：wh900124@sina.com

*通信作者：趙卓（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称范纠韺W(xué)。E-mail：zhaozhuo@buu.edu.cn