李輝敏， 殷嫦嫦， 姜登釗

（1.九江學院基礎醫(yī)學院，江西九江332000；2.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江332000）

刺頭復葉耳蕨總黃酮體內抗腫瘤作用初探

李輝敏1， 殷嫦嫦1， 姜登釗2

（1.九江學院基礎醫(yī)學院，江西九江332000；2.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江332000）

目的 研究刺頭復葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）總黃酮的體內抗腫瘤活性。方法 應用HepG2細胞裸小鼠異位移植瘤模型，通過測定抑瘤率及檢測相關生化指標、HE染色、免疫組化等方法了解其抗腫瘤作用及作用機制。結果 刺頭復葉耳蕨總黃酮能夠抑制肝癌異位移植瘤模型動物體內腫瘤生長，對實驗動物的體質量、血液系統無明顯影響，腫瘤組織中促凋亡蛋白Bax表達水平明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平明顯下調。結論 體內抗腫瘤活性的研究顯示刺頭復葉耳蕨總黃酮抗腫瘤作用可能與其誘導腫瘤細胞凋亡有關。

刺頭復葉耳蕨；總黃酮；裸小鼠；HepG2細胞；增殖

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，而我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年全球新發(fā)肝癌病例中我國占45%［1］。目前臨床肝癌診療中還存在著早期診斷難、復發(fā)轉移率高和治療手段少等問題［2］。因此，尋找和發(fā)掘新的肝癌治療藥物顯得尤為重要和迫切。近年來，多傾向于采用綜合措施治療肝癌，其中中醫(yī)藥是非常重要的一部分。中醫(yī)藥在抗癌方面展現出獨到的優(yōu)勢，因其抗腫瘤作用溫和，能增強機體免疫功能，緩解癥狀，減少治療的不良反應等作用而受到了眾多學者的研究和關注［3］。

刺頭復葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）為鱗毛蕨科復葉耳蕨屬植物，廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶濕潤區(qū)域，以亞洲東部和東南部種類最為豐富，我國主要分布于長江流域以南地區(qū)及山東、河南等省，具有清熱利濕，抗菌消炎，鎮(zhèn)靜作用，民間用于治療急性黃疸型肝炎、關節(jié)炎、痢疾、燙火傷等［4］。有研究表明鱗毛蕨類植物有包括抗病毒、

抗腫瘤等藥理作用，產生這些藥理作用的成分是黃酮類化合物或總間苯三酚類化合物［5］。本研究應用HepG2細胞裸小鼠異位移植瘤模型，通過測定抑瘤率及檢測相關生化指標、HE染色、免疫組化等方法了解刺頭復葉耳蕨總黃酮抗腫瘤作用機制。

1 材料與儀器

1.1 樣品與試劑 刺頭復葉耳蕨根莖采自江西省星子縣，由九江學院基礎醫(yī)學院高春華教授鑒定為鱗毛蕨科（Dryopteridaceae）復葉耳蕨屬（Arachniodes）刺頭復葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）；刺頭復葉耳蕨總黃酮：取刺頭復葉耳蕨75%乙醇提取液濃縮后經聚酰胺純化得到刺頭復葉耳蕨洗脫液，濃縮、冷凍干燥而得；測定總黃酮的量為82.86%。5-氟尿嘧啶 （5-FU）針劑 （上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號121208）；DMEM/F-12培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清［TransGen Biotech（TRANS）］；胰蛋白酶、二甲基亞砜 （DMSO）、瓊脂糖（Solarbio公司）；DMSO（AR，天津科密歐化學試劑公司）；總蛋白提取試劑盒 （北京艾德萊公司）；4%多聚甲醛固定液、蘇木精-伊紅染色液（湖北百奧斯生物科技有限公司）；Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒（美國eBioscience公司）；其余所有試劑，均為分析純。

1.2 細胞株與實驗動物 人肝癌HepG2細胞株由同濟醫(yī)院肝膽外科提供。BALB/c-nu免疫缺陷裸小鼠 （SPF級）25只，4～5周齡，雄性，購自湖南長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（湘）2009-0004。

1.3 主要儀器 BT224S型電子天平 （德國賽多利斯）；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱 （SIM公司）；離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Olympus-Ckx41熒光倒置顯微鏡 （日本Olympus公司）；游標卡尺 （哈爾濱量具刃具集團公司）；細胞計數板（上海愛寶醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

將HepG2細胞接種于DMEM培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清），在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔2～3 d換液一次至細胞生長至鋪滿瓶底90%左右時傳代。

在免疫缺陷的裸小鼠體內異位移植人肝癌HepG2細胞，建立動物肝癌異位移植性腫瘤模型，通過分組給藥，對腫瘤生長相關指標進行評價，對相關生物樣品進行生化、病理檢測，對腫瘤組織中部分凋亡相關蛋白的表達進行檢測，探討刺頭復葉耳蕨總黃酮體內抗腫瘤作用及其機制。

2.1 樣品配制 陰性對照：精密稱取羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）1.0 g置于200 mL蒸餾水中，充分溶脹，加熱溶解，配制成為0.5%CMC-Na溶液。陽性對照：取5-FU適量加入蒸餾水配制成為相應質量濃度對照溶液。樣品溶液：分別精密稱取一定量的刺頭復葉耳蕨總黃酮樣品，加適量0.5%CMC-Na溶劑，混合均勻配制不同質量濃度樣品溶液。

2.2 動物腫瘤模型的制備 取處于對數生長期的HepG2細胞，以不含血清的培養(yǎng)液沖洗2次，重懸，調整計數至約為1×107/mL。分別吸取以上細胞懸液0.2 mL接種于每只裸鼠的背部皮下。

2.3 給藥分組 免疫缺陷的裸小鼠接種人肝癌HepG2細胞后密切觀察其接種部位的腫瘤生長情況。將試驗動物隨機分為陰性對照組，陽性對照組，刺頭復葉耳蕨低劑量組、高劑量組，每組6只，分別以0.5%CMC-Na溶液、10 mg/kg 5-FU、500 mg/kg總黃酮、125 mg/kg總黃酮進行給藥。各組動物均采用腹腔注射 （ip）給藥，隔天給藥一次，連續(xù)4周。觀察腫瘤生長情況。

2.4 評價指標 在裸小鼠體外測量腫瘤的長徑（a）及短徑 （b），計算體積 （V，mm2）；計算相對腫瘤體積（RTV）。V=（a×b2）/2，RTV=Vt/ V0（V0為首次分組給藥時測得的腫瘤體積，Vt為以后每次測量時的腫瘤體積）。

2.5 病理檢測 各組實驗動物給藥結束后，處死并進行解剖，分別收集其血樣及腫瘤組織；取血液標本進行部分相關生化指標檢測；取部分腫瘤組織標本，以4%多聚甲醛溶液固定，進行相關病理檢測，凍存其余腫瘤組織。

2.5.1 血液分析 取各組全血樣本進行相關血液分析，對血樣中紅細胞 （RBC）、白細胞 （WBC）、血小板 （PLT）分別計數，測定血紅蛋白（Hb）量。

2.5.2 組織形態(tài)觀察 取各組腫瘤組織按照蘇木精-伊紅 （HE）染色法進行染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)。

2.5.3 免疫組織化學分析［6］取各組實驗動物腫瘤組織，常規(guī)制片，分別按Bcl-2、Bax的免疫組化試劑盒說明書方法，對其進行免疫組織化學檢測，分析Bcl-2、Bax蛋白在腫瘤組織中的表達情況。

3 結果

3.1 實驗動物一般狀況的觀察 在接種HepG2細

胞一段時間后，各實驗動物可見接種部位的皮下出現明顯腫塊，表明異位移植人肝癌HepG2細胞裸小鼠腫瘤模型建立成功；各組實驗動物在實驗過程中飲食、飲水及排泄均正常，基本狀況表現良好；實驗結束后對各組實驗裸小鼠進行解剖觀察，無明顯臟器損傷。

3.2 刺頭復葉耳蕨總黃酮對肝癌模型裸鼠腫瘤生長的影響 結果見圖1，與陰性對照組動物進行比較，實驗動物用不同質量濃度的刺頭復葉耳蕨總黃酮樣品溶液進行治療后，其移植瘤生長速度明顯下降，顯示刺頭復葉耳蕨總黃酮具有良好的抑制人肝癌異位移植瘤模型裸鼠體內腫瘤生長的作用。

圖1 刺頭復葉耳蕨總黃酮對裸鼠腫瘤生長的影響Fig.1 Effects of Arachniodes exilis totaI fIavonoids on the grow th of tumor in nudem ice

對各實驗動物組的相對腫瘤體積變化情況進行統計分析，結果見圖2。

圖2 各組肝癌異位移植瘤模型裸鼠的相對腫瘤體積的變化Fig.2 Changes of the reIative tumor voIumes of tumorbearingm ice in each group

3.3 刺頭復葉耳蕨總黃酮對肝癌模型裸鼠血液的影響 結果見表1。分組給藥4周后，對各組實驗動物的血液部分生化指標檢測結果統計分析發(fā)現，陽性對照組 （5-FU給藥組）與陰性對照組實驗動物比較，其相應血小板指標的檢測結果有顯著性差異，證明5-FU對實驗動物血液具有一定毒性。而不同質量濃度刺頭復葉耳蕨總黃酮處理組與陰性對照組實驗動物各檢測結果統計分析無顯著性差異，這就提示了刺頭復葉耳蕨總黃酮對模型裸鼠無明顯的血液損傷。

3.4 腫瘤組織形態(tài)學觀察 各組實驗動物腫瘤組織的HE染色結果如圖3所示，陰性對照組裸鼠的腫瘤組織中癌細胞排列較緊密、核大且具異型性、核胞質比大；而經不同劑量刺頭復葉耳蕨總黃酮和陽性對照5-FU處理后的模型動物腫瘤組織中細胞排列較稀疏，可見細胞皺縮、破碎、染色質消失等現象，表現出了不同程度的壞死。

表1 裸鼠血液學指標的檢測Tab.1 Assays of the haematoIogicaI indexes of nudem ice

表1 裸鼠血液學指標的檢測Tab.1 Assays of the haematoIogicaI indexes of nudem ice

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05

組別 紅細胞/（×1012.L-1） 白細胞/（×109.L-1） 血小板/（×109.L-1） 血紅蛋白/（g.L-1）9.60±1.62 12.26±2.43 686.20±105.99 163.18±24.01刺頭復葉耳蕨總黃酮低劑量組 9.54±1.75 12.14±2.39 678.02±128.52 165.60±15.92刺頭復葉耳蕨總黃酮高劑量組 9.18±1.34 11.66±1.34 669.42±95.46 158.49±27.73陽性對照組 9.12±1.31 7.56±1.44*陰性對照組618.78±93.81 154.74±26.53

圖3 各組裸鼠腫瘤組織HE染色Fig.3 HE stainings of tumor tissues beIonging to nude m ice in different groups

3.5 免疫組織化學法檢測 運用免疫組織化學方法對各組實驗動物腫瘤組織中Bcl-2、Bax的蛋白表達進行了檢測，結果見圖4、圖5。

如圖4所示，經過不同劑量的刺頭復葉耳蕨總黃酮處理后，與陰性對照組相比，實驗動物肝癌異位移植瘤模型裸鼠腫瘤組織中抗凋亡相關蛋白Bcl-2的表達陽性率明顯降低。

如圖5所示，經過不同劑量的刺頭復葉耳蕨總黃酮處理后，與陰性對照組比較，實驗動物腫瘤組織中的促凋亡蛋白Bax的表達陽性率明顯增加；結合抗凋亡蛋白Bcl-2的測定結果，說明經過不同劑量的刺頭復葉耳蕨總黃酮處理后，可能引起模型動物腫瘤組織中肝癌細胞的凋亡。

4 討論

本研究通過建立肝癌異位移植瘤模型，考察了刺頭復葉耳蕨總黃酮的體內抗腫瘤作用。通過觀察藥物對模型動物的腫瘤生長的影響，測定部分血液學指標以及對腫瘤組織進行HE染色觀察組織壞死情況等試驗，證實刺頭復葉耳蕨總黃酮能夠抑制肝癌異位移植瘤模型動物體內腫瘤生長，同時其對實驗動物的血液系統沒有明顯的影響，提示其在體內應用時可能不良反應較少發(fā)生。

圖4 腫瘤組織中凋亡相關蛋白BcI-2的表達Fig.4 Expressions of apoptosis-reIated protein BcI-2 in tumor tissues

圖5 腫瘤組織中凋亡相關蛋白Bax的表達Fig.5 Expressions of apop tosis-reIated p rotein Bax in tumor tissues

為進一步研究刺頭復葉耳蕨總黃酮體內抗腫瘤作用機制，我們采用免疫組織化學方法對肝癌細胞增殖抑制相關蛋白進行了測定，結果顯示：經刺頭復葉耳蕨總黃酮處理后，實驗動物腫瘤組織中的促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯下調；相應Bax/Bcl-2比例增大。Bcl-2家族作為復雜作用網絡共同參與細胞凋亡的調控，成為惡性腫瘤治療的靶標之一［7］。Bcl-2家族包括抑凋亡基因群（如Bcl-2、Bcl-xl

等）和促凋亡基因群 （如Bax、Bad等），各基因群發(fā)揮不同的作用，促進凋亡與抑制凋亡作用相互制約，其中Bax和Bcl-2基因具有40%的同源性［8-9］，當Bax/Bcl-2比例較高時，細胞趨于凋亡，反之則細胞凋亡下降［10-12］。免疫組織化學實驗結果顯示肝癌移植瘤模型裸鼠腫瘤組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低，促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高，從整體動物水平證實了刺頭復葉耳蕨總黃酮抗腫瘤作用與其促腫瘤細胞凋亡相關。

本項實驗采用了肝癌異位移植瘤模型裸鼠作為實驗動物，初步評價了刺頭復葉耳蕨總黃酮體內抗肝癌的效果，并探討了其在體內抗癌作用的可能機制。肝癌異位移植瘤動物模型操作簡單、腫瘤潛伏期短、模型成瘤率高，并且具有便于從體外觀察等特點［13-14］，能大大縮短實驗周期，適用于對抗腫瘤藥物的篩選。

在今后的實驗中，還需要通過增加實驗動物的例數以使得實驗結果更加準確可靠、更具有說服力，此外還可使用其他肝癌動物模型來驗證刺頭復葉耳蕨總黃酮的體內抗肝癌作用。

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Anti-tumor effect of totaI fIavonoids from Arachniodes Exilis Ching in vivo

LIHui-min1， YIN Chang-chang1， JIANG Deng-zhao2

（1.Basic Medical Gollege of Jiujiang University，Jiujiang 332000，Ghina；2.School of Pharmacy and Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，Ghina）

AIM To investigate the effects of total flavonoids from Arachniodes Exilis Ching on anti-tumor activity in vivo.METHODS HepG2 cell heterotopic graftmodelwas setup in nudemice，inhibitory rate and biochemical indices were determined，then HE staining and immunohistochemistry were performed to determine its mechanism of action.RESULTS Tumor growth in nudemicewith hepatoma heterotopic graftwas inhibited by total flavonoids from A.Exilis.Ithad no significant influence with theweightand blood system of experimentalmice. Meanwhile，the expression levels of pro-apoptotic protein Bax in tumor tissue weremarkedly increased.However，anti-apoptotic protein Bcl-2 expression levelsweremarkedly reduced.CONCLUSION Studies on anti-tumor activity in vivo show that the anti-tumor effects of total flavonoids from A.Exilis may be related to induced-apoptosis of tumor cells.

Arachniodes Exilis Ching；total flavonoids；nudemice；HepG2 cell；proliferation

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2347-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.003

2014-12-01

國家自然科學基金 （81160536）；江西省教育廳資助項目 （GJJ12737）

李輝敏 （1974—），女，博士，副教授，從事中藥藥效物質基礎與作用機制研究。Tel：（0792）8568166，E-mail：13970280063@163.com