衛(wèi) 強(qiáng), 李前榮, 尹 浩, 紀(jì)小影, 徐 飛
(1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院,安徽合肥230088;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥230026)
超臨界CO2萃取法與水蒸氣蒸餾法提取垂絲海棠葉揮發(fā)油成分及其抗氧化活性的比較
衛(wèi) 強(qiáng)1, 李前榮2, 尹 浩2, 紀(jì)小影1, 徐 飛1
(1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院,安徽合肥230088;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥230026)
目的 比較以超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾法提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油成分及其抗氧化活性的差別。方法 采用超臨界CO2萃取法和水蒸氣蒸餾法從垂絲海棠葉中提取揮發(fā)油,氣相色譜-高分辨質(zhì)譜 (GC-HRMS)法對(duì)其成分進(jìn)行分析,歸一法確定其相對(duì)百分含有量。結(jié)果 從超臨界CO2萃取的揮發(fā)油中鑒定出30個(gè)成分,占總離子流圖峰面積的65.72%;從水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中鑒定出27個(gè),占91.96%。兩種揮發(fā)油中有9種共同成分。另外,超臨界CO2萃取法所得的揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和NaNO2的清除能力均強(qiáng)于水蒸氣蒸餾法所得的揮發(fā)油和維生素C。結(jié)論 兩種不同提取工藝下垂絲海棠葉揮發(fā)油成分的差別較大,超臨界CO2萃取中揮發(fā)油成分抗氧化活性較強(qiáng)。
垂絲海棠葉;揮發(fā)油;超臨界CO2萃??;水蒸氣蒸餾;GC-HRMS;抗氧化活性
海棠為薔薇科蘋果屬觀賞植物,其種類有西府海棠Malusmicromalus、垂絲海棠M.halliana、楸子M.prunifolia、湖北海棠M.hupehensis、三葉海棠M.sieboldii等,因其花果有觀賞價(jià)值、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于園林景觀中[1]。其中,垂絲海棠M.halliana koehne廣泛分布于我國(guó)華東及西南地區(qū),其花入藥,能調(diào)經(jīng)、和血、治崩漏[2]。
在人類各種疾病中,有90%以上源于活性氧和氧化應(yīng)激,而體內(nèi)過多的氧自由基則會(huì)損害人體健康,可導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損傷,引起多種疾病,如炎癥、輻射損傷、腫瘤、帕金森病、老年癡呆癥和心臟病等[3-4]。多糖具有廣泛的生物活性,而抗氧化作用是其抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn),垂絲海棠等7種常見觀賞海棠果實(shí)提取物的多酚和黃酮類成分具有較強(qiáng)的抗氧化作用[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)垂絲海棠葉中揮發(fā)油類成分采用超臨界CO2萃取 (SFE-CO2)和水蒸氣蒸餾法提取,GC-HRMS法進(jìn)行成分分析,比較抗氧化活性,以期為其應(yīng)用開發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)。
HA221-50-01型超臨界萃取設(shè)備 (江蘇南通華安超臨界萃取有限公司);氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (英國(guó)Micromass公司);FA1004型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);FY130型中藥粉碎機(jī) (天津泰斯特儀器有限公司);揮發(fā)油測(cè)定器 (合肥三元化玻儀器公司)。所用試劑均為分析純 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為蒸餾水。垂絲海棠葉采自安徽合肥大蜀山地區(qū),經(jīng)安徽新華學(xué)院劉金旗副教授鑒定為垂絲海棠Malus halliana koehne的莖上葉。
2.1 揮發(fā)油的提取
2.1.1 超臨界流體萃取 稱取垂絲海棠葉粗粉50 g,置于萃取釜中 (壓力20 MPa;溫度40℃;萃取時(shí)間120 min;分離釜Ⅰ壓力15 MPa,溫度為40℃;分離釜Ⅱ壓力8MPa,溫度35℃)。萃取物經(jīng)減壓蒸餾得揮發(fā)油,呈淺綠色,提取三次,以油重/樣品重測(cè)得平均收率為2.10%。
2.1.2 水蒸氣蒸餾法 稱取垂絲海棠葉粗粉50 g,按 《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定方法進(jìn)行操作,連續(xù)蒸餾6 h,收集揮發(fā)油,均呈淺綠色,提取三次,以油重/樣品重測(cè)得平均收率為1.87%。
2.2 GC-MS測(cè)定參數(shù) Agilent DB-5MS色譜柱(30 mm× 0.25 mm,0.25μm);載氣為高純氦氣;體積流量 1 m L/m im;進(jìn)樣量2μL;分流比10:1;氣化溫度280℃;GC-MS接口溫度280℃;GC升溫程序?yàn)槌跏?0℃,恒溫0.5 m in,以8℃/min速率升至280℃,保持10m in;EI電離方式;電子能量70 eV;分辨率7 000 FWHM;離子源溫度220℃;EI收集電流250μA;內(nèi)標(biāo)為全氟三丁基胺;m/z218.985 6處作單點(diǎn)鎖定矯正精確質(zhì)量。軟件包括13
萬張標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖NIST庫的檢索功能。
2.3 揮發(fā)油化學(xué)成分分析 對(duì)總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后,得到質(zhì)譜圖,通過工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索,確認(rèn)各化合物。然后,經(jīng)工作站數(shù)據(jù)系統(tǒng)處理,按峰面積歸一化法計(jì)算各化合物在揮發(fā)油中的百分含有量。
2.4 垂絲海棠葉揮發(fā)油的抗氧化活性測(cè)定
2.4.1 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定
根據(jù)文獻(xiàn) [7-8],分別取超臨界CO2和水蒸氣蒸餾法提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油20~100μL,置于5支試管中,加丙酮至100μL。再分別加入質(zhì)量濃度為24 mg/L的DPPH 95%乙醇溶液5 mL,避光反應(yīng)2 h后,于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸收度(Ai),以DPPH 95%乙醇溶液為空白對(duì)照,測(cè)定對(duì)照組吸光度(A0),以1 mg/m L維生素C(Vc)為陽性對(duì)照,按如下公式計(jì)算清除率。
清除率=(1-Ai/A0)×100%
2.4.2 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2清除作用的測(cè)定 取質(zhì)量濃度為0.5 mol/L的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH為3.0)5.0 mL,置于10 mL量瓶中,分別加入0.1 g/L的NaNO2溶液1mL、超臨界CO2和水蒸氣蒸餾法提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油各20~100μL,蒸餾水定容,搖勻,于37℃下反應(yīng)1 h。再精密移取反應(yīng)液1 mL,加入質(zhì)量濃度為4 g/L的對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL和質(zhì)量濃度為2 g/L的N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液1 m L,搖勻,靜置10 min,在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)x,以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,測(cè)定吸光度A0,以1 mg/mL維生素C(Vc)為陽性對(duì)照,按如下公式計(jì)算清除率。
清除率=[(A0-Ax)/A0]×100%
3.1 揮發(fā)油化學(xué)成分分析 超臨界CO2萃取、水蒸氣蒸餾法提取垂絲海棠葉揮發(fā)油的氣相色譜圖見圖1、圖2,GCMS法分離鑒定出其中的揮發(fā)性成分見表1和表2。由圖可知,SFE-CO2萃取所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中已鑒定成分占總離子流圖峰面積的65.72%,而水蒸氣蒸餾所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中已鑒定成分占91.96%。揮發(fā)油主要由萜類、芳香族、脂肪族化合物等組成,通過對(duì)兩種方法所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)SFE-CO2萃取法揮發(fā)油中萜類成分有26種,占83.87%,芳香族成分有2種,占6.45%,脂肪族成分有3種,占9.68%;水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中萜類成分有24種,占85.71%,芳香族成分有3種,占10.71%,脂肪族成分有1種,占3.57%。
由表可知,SFE-CO2萃取和水蒸氣蒸餾法所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中,含有9種共同化學(xué)成分,分別為1,8-桉葉素、馬鞭烯醇、樟腦、龍腦、反式乙酸菊烯酯、β-順式金合歡烯、柏木烯、β-柏木烯、表藍(lán)桉醇。其中,反式乙酸菊烯酯含有量較高,分別為25.02%、60.46%。
圖1 垂絲海棠葉揮發(fā)油(SFE-CO2萃取)的總離子流圖
圖2 垂絲海棠葉揮發(fā)油 (水蒸氣蒸餾)的總離子流圖
表1 垂絲海棠葉揮發(fā)油(SFE-CO2萃?。└叻直尜|(zhì)譜數(shù)據(jù)
3.2 垂絲海棠葉揮發(fā)油的抗氧化活性測(cè)定
3.2.1 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用(圖3)由圖可知,垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用,當(dāng)其體積達(dá)到100μL時(shí),清除率最大。其中,SFE-CO2法所得揮發(fā)油的清除率為72.8%,高于1mg/mL Vc,而水蒸氣蒸餾所得揮發(fā)油的清除率為62.6%,低于1 mg/mL Vc。揮發(fā)油和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率與樣品體積呈正相關(guān),垂絲海棠葉揮發(fā)油 (SFE-CO2)、垂絲海棠葉揮發(fā)油 (水蒸氣蒸餾)、Vc樣品體積(Y)與清除率(X)的回歸方程分別為Y= 0.474X+28.43,r=0.985、Y=0.464X+22.43,r=0.993、Y= 0.559X+5.13,r=0.968。當(dāng)清除率為50%時(shí),三者的體積分別為45.51、59.42、80.27μL。
表2 垂絲海棠葉揮發(fā)油 (水蒸氣蒸餾)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)
圖3 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用
3.2.2 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除作用 (圖4)由圖可知,垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2有一定的清除作用,當(dāng)其體積達(dá)到100μL時(shí),水蒸氣蒸餾、SFE-CO2所得揮發(fā)油的清除率均高于1 mg/mL Vc,分別為80.1%、69.8%。垂絲海棠葉揮發(fā)油 (SFE-CO2)、垂絲海棠葉揮發(fā)油 (水蒸氣蒸餾)、Vc樣品體積 (Y)與清除率 (X)的回歸方程分別為Y=0.384X+41.23,r=0.990、Y=0.539X+ 17.93,r=0.989、Y=0.314X+36.83,r=0.978。當(dāng)清除率為 50%時(shí),三者的體積分別為 22.84、59.50、41.94μL。
SFE-CO2萃取的垂絲海棠葉揮發(fā)油中主要含反式乙酸菊烯酯、乙酸龍腦酯、大牻牛兒烯-D、馬鞭烯醇、柏木烯、西車烷、3,15-dideacetylcalonectrin,占41.14%,而水蒸氣蒸餾提取的垂絲海棠葉揮發(fā)油中主要含乙酸菊烯酯、馬鞭烯醇、樟腦、1,5-diisopropenyl-4-(1-methylprop-2-enyl)cyclohexene、石竹烯、α-柏木烯、β-柏木烯,占78.87%。其中,乙酸菊烯酯為鵝不食草揮發(fā)油中的主要成分[9-10],可用于治療治療急、慢性鼻炎引起的鼻塞,頭痛腦脹[11];乙
圖4 垂絲海棠葉揮發(fā)油對(duì)NaNO2的清除作用
酸龍腦酯具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用[12];石竹烯具有局部麻醉、治療結(jié)腸炎、空氣清潔作用[13]。另外,SFE-CO2萃取的揮發(fā)油中含不飽和雙鍵的萜類成分占83.87%,它具有抗氧化功能[14],可能是其強(qiáng)抗氧化活性的內(nèi)在原因。
SFE-CO2萃取和水蒸氣蒸餾法所得的垂絲海棠葉揮發(fā)油中均含有1,8-桉葉素、馬鞭烯醇、樟腦、龍腦、反式乙酸菊烯酯、β-順式金合歡烯、柏木烯、β-柏木烯、表藍(lán)桉醇這9種成分。其中,反式乙酸菊烯酯在兩種揮發(fā)油中均具有較高的含有量,分別為25.02%、60.46%。
自由基是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物,普遍存在于人體內(nèi),通常為最外層電子軌道上的未成對(duì)電子、獨(dú)立存在原子、原子團(tuán)、分子或離子[15]。1956年,Denham Harman提出衰老的自由基學(xué)說,認(rèn)為衰老過程導(dǎo)致的退行性改變是由于細(xì)胞代謝產(chǎn)生的自由基引起的,它可誘發(fā)DNA損傷、突變、腫瘤形成,氧化細(xì)胞中的多種物質(zhì)可損害生物膜,使蛋白質(zhì)、核酸等大分子發(fā)生交聯(lián),從而產(chǎn)生功能異常,而機(jī)體抗氧化能力的提高能對(duì)抗活性氧引發(fā)的各種疾病[16-17]。DPPH自由基清除率測(cè)定法廣泛應(yīng)用于定量測(cè)定生物試樣、各類物質(zhì)和食品的抗氧化能力,具有快速、易重復(fù)、簡(jiǎn)單、靈敏、不需要復(fù)雜儀器等優(yōu)點(diǎn)。另外,國(guó)內(nèi)研究表明,在胃部酸性條件下,亞硝酸鹽與胺類同時(shí)存在時(shí)將形成亞硝胺,它是公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物之一[18],而低劑量亞硝酸鈉可促進(jìn)人肝癌MMC-7721細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),超臨界CO2萃取的揮發(fā)油在抗氧化活性上優(yōu)于水蒸氣蒸餾,推測(cè)可能是由于水蒸氣提取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 h,而且在高溫下加熱,成分破壞嚴(yán)重,影響了其活性作用。
[1] 孫匡坤.垂絲海棠(Malus halliana)和重瓣垂絲海棠(Malushalliana var.parkmanii)的生殖生物學(xué)研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2013.
[2] 余 梅,尹藝林,閔運(yùn)江.垂絲海棠保健飲料的加工工藝[J].安慶師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,9(3):50-51.
[3] 鄧 薏.近五年國(guó)內(nèi)中藥抗氧化作用研究進(jìn)展 (上)[J].中藥藥理與臨床,2012,28(6):156-162.
[4] Nystr?m T.The free-radicalhypothesis of aging goes prokaryotic[J].Gell Mol Life Sci,2003,60(7):1333-1341.
[5] 羅祖友,吳季勤,吳謀成.植物多糖的抗氧化與抗病毒活性[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,25(1):77-81.
[6] 陳芳甜.觀賞海棠果抗氧化活性的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.
[7] 賈紅麗,張丕鴻,計(jì)巧靈,等.新疆阿勒泰百里香揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS分析及抗氧化活性測(cè)定[J].食品科學(xué),2009,30(4):224-229.
[8] 趙金偉,李范洙,張 先.蘋果梨酚類物質(zhì)抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2010,31(17):170-172.
[9] 鄭虎占,藍(lán)澤宏,佘 靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用:第六卷[M].北京:學(xué)苑出版社,1999:5874.
[10] 劉 杰,侯惠鳴,屠萬倩.鵝不食草揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中草藥,2002,33(9):785-786.
[11] 劉 杰,王曙炎,都恒青.氣相色譜法測(cè)定鼻塞通噴霧劑中乙酸菊烯醋的含量[J].藥物分析雜志,2005,25(7):840-842.
[12] 吳曉松.李曉光,肖 飛,等.砂仁揮發(fā)油中乙酸龍腦酯鎮(zhèn)痛抗炎作用的研究[J].中藥材,2004,27(6):438-439.
[13] 陳旭冰,仝 誠(chéng),陳光勇.β-石竹烯的研究進(jìn)展[J].山東化工,2011,40(7):34-36.
[14] 滕 坤,張海豐,徐 敏,等.赤松與長(zhǎng)白赤松松針揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].藥物分析雜志,2011,31(11):2121-2125.
[15] Wickens A P.Ageing and the free radical theory[J].Resp Physiol,2001,128(3):379-391.
[16] 王春霖,郭 芳,王永利.自由基與衰老[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(4):308-311.
[17] Chen H Y,Lin Y C,Hsieh C L.Evaluation of antioxidant activity of aqueous extract of some selected nutraceutical herbs[J].Food Ghem,2007,104(4):1418-1424.
[18] 葛麗娜,韓 雪,任珂珂,等.火棘花揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析及抗氧化活性研究[J].植物研究,2014,34(2):276-281.
[19] 張付利,厲永強(qiáng),史 齊,等.亞硝酸鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(2):191-195.
R284.2
B
1001-1528(2015)11-2550-05
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.051
2014-07-28
國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目 (AH201412216010,201412216008);安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目 (2013gxk105);安徽新華學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目(2013gxkcx01)
衛(wèi) 強(qiáng)(1977-),男,碩士,副教授,從事藥學(xué)教學(xué)與科研工作。E-mail:weiqiang509@sina.com