秦亞東， 汪榮斌，2， 周娟娟

（1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖241002；2.安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖241317；3.安徽蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽蕪湖241000）

白芍多糖脫色工藝研究

秦亞東1， 汪榮斌1，2， 周娟娟3

（1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖241002；2.安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖241317；3.安徽蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽蕪湖241000）

目的 優(yōu)化白芍多糖脫色的最佳工藝。方法 分級醇沉技術(shù)得到不同組分的白芍多糖，研究粉末活性炭、顆?；钚蕴俊⑦^氧化氫、次氯酸鈉對其脫色效果的影響，單因素和正交試驗優(yōu)化脫色工藝，并對脫色前后多糖進行UV、IR分析。結(jié)果 白芍多糖色素主要集中在PRPS90組分。該組分白芍多糖最優(yōu)脫色工藝為溫度為65℃，過氧化氫體積分數(shù)為20%，調(diào)節(jié)pH值為9，脫色3.5 h。經(jīng)UV、IR分析，脫色前后結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。結(jié)論 該工藝穩(wěn)定可行，易于操作，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

白芍；多糖；脫色工藝；單因素試驗；正交試驗；UV；IR

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，氣微寒，味微苦、酸，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效［1］，藥用已有2 000余年的歷史。該植物主產(chǎn)于安徽、浙江、四川等地，其中亳州產(chǎn)者又稱亳白芍，因其量大質(zhì)優(yōu)而成為安徽的道地藥材之一，已形成大規(guī)模規(guī)范GAP種植基地［2］。

多糖的生物活性被不斷發(fā)現(xiàn)，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗補體［3-7］等，其重要性日益顯著。然而，許多中藥多糖提取液都有很深的顏色，嚴重影響了深層次的研究與開發(fā)，故多糖脫色是一個重要環(huán)節(jié)。目前，常用的脫色方法有離子交換樹脂法、活性炭法、雙氧水法、次氯酸鈉法［8-10］等，各具特點，但鮮有對白芍多糖進行脫色研究的文獻報道。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上［11-12］繼續(xù)探索白芍多糖脫色工藝，在熱水浸提、乙醇分級沉淀后，得到不同分子量組分的多糖，發(fā)現(xiàn)其溶液顏色差異較大，故以脫色率、多糖保留率為指標，對不同組分白芍多糖進行脫色工藝研究，以期為其深入開發(fā)提供一些理論依據(jù)。

1 材料與儀器

Cary60紫外分光光度計、Nicolet6700紅外光譜儀（美國Agilent公司）；FD8-10冷凍干燥機（美國西盟國際公司）；201203酒精計 （河北武強縣億達儀表廠）；3-18K離心機 （德國Sigma公司）；MS104S電子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。藥材 （批號2103-06）采自安徽亳州白芍種植基地，由安徽中藥資源研究所劉曉龍研究員鑒定為白芍。葡萄糖 （中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201205）。苯酚等試驗用試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 白芍多糖分級提取 稱取白芍300 g，粉碎，過60目篩，加10倍量無水乙醇浸泡24 h，雙層紗布濾過，濾渣再加8倍量無水乙醇浸泡24 h，雙層紗布濾過，以除去脂類、色素等雜質(zhì)。

藥渣自然干燥，分別用8、6倍量蒸餾水回流提取2次，每次2 h，合并濾液，水浴濃縮。待濾液溫度冷卻至室溫后，緩慢攪拌加入無水乙醇，酒精計調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)為35%，冰水浴中靜置過夜，離心得到多糖沉淀，無水乙醇、丙酮、無水乙醚各沖洗2次，復(fù)溶于水后冷凍干燥，得到該組分多糖粉末，命名為PRPS35；向上述濾液中繼續(xù)加無水乙醇，調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)為70%，其他處理方式相同，得到PRPS70；同法調(diào)節(jié)乙醇體積分數(shù)為90%，得到PRPS90。由于繼續(xù)加無水乙醇使乙醇體積分數(shù)升高后，所得多糖很少，故未做研究。

2.2 不同組分白芍多糖溶液顏色比較 分別稱取 “2.1”項下制得的PRPS35、PRPS70、PRPS90粉末約20 mg，置于10 mL量瓶中（2 mg/mL），蒸餾水定容，5 000 r/min離心，取上清液備用。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，PRPL35溶液澄清無色，PRPS70溶液白色渾濁，PRPS90溶液澄清橙黃色。

上述溶液在可見光區(qū) （400～700 nm）進行掃描，未發(fā)現(xiàn)有最大吸收峰。PRPS90溶液在可見光區(qū)呈現(xiàn)普遍吸收現(xiàn)象，從溶液互補色的角度考慮，選擇450 nm為色素吸收檢測波長。上述不同組分多糖溶液的顏色及在450 nm下的吸光度見表1，由于只有PRPS90溶液呈明顯橙黃色，并且吸光度較大，而其他兩個組分多糖溶液在該波長下的吸光度

較小，故本實驗對PRPS90組分多糖進行脫色工藝研究。

表1 不同組分白芍多糖溶液顏色及吸光度

2.3 多糖脫色率、保留率的測定 取脫色前后的多糖溶液各2 mL，在450 nm下測定吸光度，脫色率=（溶液脫色前吸光度值-溶液脫色后吸光度值）/溶液脫色前吸光度值×100%。精密量取PYPS多糖溶液1 mL，測定吸光度，代入葡萄糖回歸方程中求得溶液中葡萄糖濃度，F(xiàn)=W/C× D。再取脫色前后的多糖溶液各2 mL，在490 nm下測定吸光度，根據(jù)葡萄糖標準工作曲線計算多糖含有量及保留率。多糖含有量=C×D×F/W×100%（W為白芍多糖質(zhì)量，mg；C為多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/m L；F為換算因子；D為稀釋因子），保留率=脫色后多糖含有量/脫色前多糖含有量×100%。

2.4 標準工作曲線制備 精密吸取不同濃度葡萄糖標準溶液2.0 mL，置于具塞棕色試管中，加入6.0%苯酚溶液1.0 mL，振搖均勻，再加入濃硫酸5.0 mL，立即振搖均勻，水浴 （100℃）加熱20 min，取出放至室溫，490 nm波長下測定吸光度值，蒸餾水同法操作，作為空白對照。以葡萄糖質(zhì)量濃度 （μg/mL）為橫坐標 （C），吸光度為縱坐標（A），得到回歸方程A=8.364 3C+0.028 5，線性系數(shù)r=0.999 3，表明葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度在2.4～14.4 μg/m L之間時，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 白芍多糖脫色方法考察

2.5.1 粉末活性炭脫色 取“2.2”項下PRPS90多糖溶液10 m L，加入粉末活性碳0.2 g，5%NaOH調(diào)節(jié)pH=7，50℃水浴下不斷攪拌30 min，離心除去粉末活性炭。放至室溫后分別取脫色處理前后的多糖溶液，測定吸光度，計算脫色率及多糖保留率。

2.5.2 顆?；钚蕴棵撋?取“2.2”項下PRPS90多糖溶液10 m L，加入顆?；钚蕴?.2 g，5%NaOH調(diào)節(jié)pH=7，50℃水浴下不斷攪拌30 min，雙層濾紙除去顆?；钚蕴俊７胖潦覝睾蠓謩e取脫色處理前后的多糖溶液，測定吸光度，計算脫色率及多糖保留率。

2.5.3 過氧化氫脫色 取 “2.2”項下PRPS90多糖溶液10 mL，加入36%過氧化氫0.3 mL，5%NaOH調(diào)節(jié)pH=7，50℃水浴下不斷攪拌30 min，加熱除去雙氧水。放至室溫后分別取脫色處理前后的多糖溶液，測定吸光度，計算脫色率及多糖保留率。

2.5.4 次氯酸鈉脫色 取 “2.2”項下PRPS90多糖溶液10 mL，加入10%次氯酸鈉0.3 m L，5%NaOH調(diào)節(jié)pH=7，50℃水浴下不斷攪拌30 min，加熱除去次氯酸鈉。放至室溫后分別取脫色處理前后的多糖溶液，測定吸光度，計算脫色率及多糖保留率。

2.6 不同脫色方法試驗考察結(jié)果 由表2可知，粉末活性炭脫色時，多糖保留率較高，但其脫色率最低，而且脫色后活性炭的濾除也較為困難；顆?；钚蕴俊⒋温人徕c脫色時，多糖保留率較高，但脫色率均不滿意；過氧化氫脫色時，脫色率和多糖保留率均最高。因此，選用過氧化氫脫色進行研究。

表2 不同脫色方法試驗結(jié)果

2.7 過氧化氫脫色單因素試驗 取 “2.2”項下PRPS90（2 mg/mL）組分白芍多糖溶液，每組20 m L，進行過氧化氫脫色單因素試驗，分別考察過氧化氫加入量、脫色時間、pH、溫度對脫色率及多糖保留率的影響。

2.7.1 過氧化氫加入量對多糖脫色率及保留率的影響 由圖1可知，當過氧化氫體積分數(shù)增大到20%時，多糖的脫色率增加幅度較大，但保留率緩慢降低；當體積分數(shù)超過20%時，多糖脫色率增加非常緩慢，但保留率急劇下降。綜合考慮，過氧化氫體積分數(shù)不宜超過20%。

圖1 過氧化氫體積分數(shù)對脫色率及多糖保留率的影響

2.7.2 脫色時間對多糖脫色率及保留率的影響 由圖2可知，在1～4 h內(nèi)，隨著脫色時間的增加，脫色率迅速增加，多糖保留率緩慢降低；當脫色時間超過4 h時，脫色率緩慢增加，但多糖保留率急劇降低。因此，脫色時間不宜超過4 h。

圖2 脫色時間對脫色率及多糖保留率的影響

2.7.3 pH對多糖脫色率及保留率的影響 由圖3可知，pH為5～9時，脫色率急劇增加，然后趨于平緩，但多糖保留率隨pH值的變化不明顯。因此，脫色pH選擇在9左右較好。

圖3 pH對脫色率及多糖保留率的影響

2.7.4 溫度對多糖脫色率及保留率的影響 由圖4可以看出，在50～70℃時，隨著溫度升高，脫色率增加幅度較大；在70～90℃時，變化不明顯。但在50～70℃時，多糖保留率逐漸下降。綜合考慮，脫色溫度以70℃為宜。

圖4 溫度對脫色率及多糖保留率的影響

2.8 正交試驗 由單因素試驗結(jié)果，選取過氧化氫加入量、脫色時間、pH、溫度作為因素，設(shè)計4因素3水平進行正交試驗，見表3。脫色作用指標為脫色率及多糖保留率，對綜合得分進行數(shù)據(jù)處理，兩者各賦予50%權(quán)重，綜合得分按脫色率×0.5+多糖保留率×0.5進行加權(quán)求和，試驗結(jié)果及方差分析見表4、表5。由表可知，影響脫色率的因素均依次為C＞A＞B＞D，影響過氧化氫對多糖保留率的因素均依次為C＞A＞D＞B，即A和C為主要影響因素，而B和D為次要影響因素。從減少耗能角度考慮，宜選用B1和D1，另外A、C因素各水平間有顯著性差異，故選A3、C2；B、D因素從考慮節(jié)能角度出發(fā)，宜選用B1、D1。綜上所述，最佳脫色條件為A3B1C2D1，即脫色溫度65℃，脫色時間3.5 h，pH=9，過氧化氫體積分數(shù)20%。

表3 因素水平

表4 正交試驗設(shè)計表及結(jié)果

表5 方差分析

2.9 驗證試驗 取白芍多糖溶液 （2 mg/mL）5份，每份20 mL，按照上述最優(yōu)方案進行脫色試驗，測得平均脫色率及多糖保留率分別為95.82%、85.26%，RSD分別為0.308 7%、0.429 3% （n=5），提示該方案重復(fù)性良好。

2.10 脫色前后結(jié)構(gòu)初步比較

2.10.1 脫色前后UV圖譜對比 取“2.2”項下PRPS90（2 mg/mL）組分白芍多糖溶液稀釋后，按 “2.8”項下最佳工藝進行脫色，然后分別對脫色前后的溶液進行UV掃描 （190～400 nm），結(jié)果見圖5。由圖可知，脫色前后白芍PRPS90溶液紫外光譜圖都呈多糖特征吸收，其中190 nm波長處附近呈強吸收，脫色前后無明顯不同。

圖5 PRPS90多糖脫色前后UV（190～400 nm）圖譜比較

2.1 0.2 脫色前后FT-IR圖譜對比 取“2.2”項下PRPS90（2 mg/mL）組分白芍多糖溶液，按 “2.8”項下最佳工藝進行脫色，然后將脫色前后的溶液進行冷凍干燥，分別取脫色前后的多糖粉末2、100 mg，瑪瑙研缽中充分研磨均勻，紅外燈下干燥，壓片，4 000～400 cm-1處掃描，結(jié)果見圖6。由圖可知，脫色前后多糖IR無明顯差異，其特征吸收峰位和強度基本相似。

圖6 PRPS90多糖脫色前后IR圖譜（4 000～400 cm-1）比較

對脫色前后的PRPS90溶液進行UV（190～400 nm）及IR（4 000～400 cm-1）圖譜分析，未發(fā)現(xiàn)其多糖結(jié)構(gòu)存在光譜學(xué)差異，表明雙氧水脫色未對PRPS90部分多糖結(jié)構(gòu)造成明顯影響。

3 討論

3.1 醇沉條件 水提醇沉是分離中藥多糖的常用手段之一，熱水提取后加入乙醇，沉淀多糖。通常水提液濃縮后溶液體積大為減少，可為后面的醇沉提供便利，但應(yīng)注意水提液濃縮后加入乙醇沉淀時可能會導(dǎo)致共沉［10］現(xiàn)象發(fā)生，得到不同分子量多糖時會產(chǎn)生很大的誤差。

3.2 本實驗首次對分級醇沉技術(shù)所得不同分子量的白芍多糖組分進行脫色工藝探索，發(fā)現(xiàn)白芍色素主要在分子量最小的PRPS90部分。目前，大部分關(guān)于中藥多糖脫色的文獻報道集中在總多糖，隨著對多糖研究的深入［13］，分級醇沉技術(shù)可以將不同分子量的多糖進行初步分離，為其單糖組成、空間結(jié)構(gòu)等方面的探索提供便利。同時，亦可以通過比較不同分子量多糖的藥理活性來篩選活性多糖所在的部位，更加有利于進一步相關(guān)研究。

3.3 優(yōu)良的脫色劑應(yīng)具有較理想的脫色效果、較高的多糖保留率，同時又易于從多糖中清除，但前提是要保證脫色前后多糖的結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變?；瘜W(xué)脫色法 （如過氧化氫等）的優(yōu)點在于脫色效率高、使用方便、易于從多糖中清除等，缺點是具有一定的氧化性，對多糖的結(jié)構(gòu)存在潛在的影響；各種樹脂、Al2O3等具有脫色條件溫和、脫色效率較高、不影響多糖結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，但缺點是成本高、操作困難、不易再生等。實驗顯示，過氧化氫對白芍多糖的脫色效果十分顯著，但其氧化性較強，鑒于實驗室條件，只對脫色前后PRPS90組分多糖做了UV、IR初步對比分析，從紫外、紅外圖譜主要吸收波數(shù)及強度中未發(fā)現(xiàn)明顯變化，可認為PRPS90組分多糖在過氧化氫脫色過程中未發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，具體還需要作更深入的研究來證實。

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1001-1528（2015）12-2783-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.049

2015-04-17

安徽省高校省級科研項目 （KJ2013B114）；安徽省高職高專院校專業(yè)帶頭人 （皖教秘人 ［2011］2號）

秦亞東 （1979—），男，碩士，講師，研究方向為中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel：13655593690，（0553）4836123，E-mail：qydgy2007@163.com