聞?dòng)琅e， 申秀麗， 張 潔

（1.宜春學(xué)院，江西宜春336000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京100850）

木犀草素-7-O-蕓香糖苷的半合成

聞?dòng)琅e1， 申秀麗1， 張 潔2

（1.宜春學(xué)院，江西宜春336000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京100850）

目的 設(shè)計(jì)橙皮苷一步法半合成木犀草素-7-0-蕓香糖苷。方法 橙皮苷與三氯化鋁絡(luò)合后溶于含吡啶的甲醇溶液中，經(jīng)過碘脫氫，生成地奧明與鋁的絡(luò)合物，密閉蒸餾除去吡啶和甲醇，進(jìn)行脫甲基反應(yīng)，得到木犀草素-7-0-蕓香糖苷。結(jié)果 HPLC測(cè)定木犀草素含有量為38.2 g/kg、木犀草苷為75.0 g/kg、地奧司明為80.4 g/kg，扣除上述雜質(zhì)后，木犀草素7-0-蕓香糖苷含有量為806.4g/kg，收率為65.7%。結(jié)論 該路線工藝簡(jiǎn)單，試劑用量少，反應(yīng)條件溫和，收率良好，具有一定的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

木犀草素7-0-蕓香糖苷；橙皮苷；半合成

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，而我國(guó)的種植及產(chǎn)量均居世界第一。然而，對(duì)柑桔的利用僅局限在果實(shí)上，對(duì)果皮還沒引起足夠的重視，柑橘皮渣作為加工副產(chǎn)品，占30%～50%，僅有少部分被回收作為陳皮和提取橙皮苷使用，其余大部分被丟棄，造成極大浪費(fèi)和環(huán)境污染。 《中國(guó)藥典》規(guī)定，青皮含橙皮苷量不得低于5.0%，陳皮含橙皮苷量不得低于3.5%［1］，并且該成分來源豐富，提取工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，每公斤90%橙皮苷僅約為180元。

木犀草素及其糖苷具有抗癡呆［2-3］、 抗菌［4-6］、 抗癌［7］、心腦血管保護(hù)［8-11］等作用，但其在天然植物中的含有量較低，《中國(guó)藥典》2005年版規(guī)定，金銀花中木犀草苷的含有量不得少于0.10%，但很多金銀花難以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)；《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，金銀花中木犀草苷含有量不得少于0.050%，菊花中木犀草苷含有量不得少于0.080%。橙皮苷半合成木犀草素-7-0-葡萄糖苷共5步，總產(chǎn)率為5.88%［12］。盡管木犀草素及其葡萄糖苷具有較好的藥理活性，但它們和大部分黃酮類化合物一樣難溶于水，口服吸收困難，生物利用度較低，臨床應(yīng)用受到限制［13］。

橙皮苷半合成木犀草素或木犀草苷所需步驟多，產(chǎn)率低，而且所得產(chǎn)物水溶性較小，而木犀草素-7-0-蕓香糖苷可溶于水，易溶于熱水，優(yōu)于木犀草素和木犀草素-7-0-葡萄糖苷。本實(shí)驗(yàn)利用三氯化鋁和橙皮苷絡(luò)合，經(jīng)密閉保溫碘脫氫生成地奧明，不經(jīng)分離而直接經(jīng)密閉蒸餾脫甲基，生成木犀草素-7-0-蕓香糖苷［14］。其半合成路線見圖1，密閉保溫反應(yīng)見圖2，密閉蒸餾見圖3。

1 材料

JNM-ECA-400超導(dǎo)NMR儀，TMS為內(nèi)標(biāo)（400 M，日本電子株式會(huì)社）；Waters ACQUITYTM UPLC色譜系統(tǒng)，包括ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱（1.7μm，2.1 mm× 50 mm）、蒸發(fā)光散射（ELS）檢測(cè)器、Waters SYNAPT MS質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；LC-UV100 HPLC色譜儀，包括紫外檢測(cè)器 （上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；202-2電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；Startoruis BS224S電子天平 （德國(guó)Startoruis公司）；溫度計(jì)；碘量瓶。木犀草素、木犀草苷對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111520-200504、111720-200602）；地奧明對(duì)照品、橙皮苷 （純度分別為90%、92%，陜西慧科植物開發(fā)有限公司）。D101大孔吸附樹脂 （滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。乙腈為色譜純；無水三氯化鋁、碘、甲醇、吡啶、磷酸、保險(xiǎn)粉、氫氧化鈉、冰醋酸均為分析純。

圖1 木犀草素-7-O-蕓香糖苷的半合成路線

圖2 密閉保溫/回流

圖3 密閉蒸餾

2 化學(xué)合成

迅速稱取無水三氯化鋁7.0 g，置于250 mL碘量瓶中，迅速加入吡啶80 mL，搖勻，放冷，加入甲醇30 mL和橙皮苷33.0 g，攪拌2 min，加入碘13.5 g，再攪拌2 min，碘量瓶上端接冷凝管，80℃下密閉反應(yīng) （防止吸收空氣中水分），每隔1 h攪拌1次，2 h后形成均勻溶液，繼續(xù)密閉反應(yīng)6 h（完成脫氫）。在氣浴中升溫至100℃，密閉蒸餾48 h或PC/TLC/HPLC跟蹤至無地奧司明發(fā)現(xiàn)（優(yōu)先聚酰胺薄層層析監(jiān)控，樣品液的制備方法為用磷酸破除鋁離子，與黃酮絡(luò)合，鹽酸水溶液中和吡啶，靜置，濾過，濾液通過大孔吸附樹脂微柱，水洗除雜，乙醇洗脫，取洗脫液作為供試品。然后點(diǎn)樣，50%乙醇展開，晾干，1%FeCl3乙醇噴霧顯色），加入保險(xiǎn)粉3.0 g，水液100 mL，攪拌5 m in，放涼，倒入磷酸20 mL、鹽酸80 mL、水液100 mL，攪拌，50℃下密閉放置2 h，濾過 （不溶物為少量地奧明和木犀草素）得酸水液，大孔吸附樹脂柱 （350 g）層析，水洗滌除去吡啶、HI、磷酸、AlCl3，60%乙醇洗脫，回收乙醇，得木犀草素-7-0-蕓香糖苷，共21.7 g。

1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.47（1H，dd，J= 8.4，2.2 Hz，H-6′），7.46（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），6.98（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.78（1H，d，J=1.8 Hz，H-8），6.77（1H，d，J=1.8 Hz，H-3），6.48（1H，d，J=1.8 Hz，H-6），5.11（1H，d，J=7.3 Hz，H-1″），4.57（1H，d，J=1.5 Hz，H-1?），4.06（1H，d，J=9.5 Hz，H-6″），3.88（1H，dd，J=3.5，1.6 Hz，H-2?），3.69（1H，dd，J=9.5，3.3 Hz，H-3?），3.18～3.68（7H，m，H-2″，3″，4″，5″，6″a，4?，5?），1.10（3H，d，J=6.2 Hz，H-6?）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：182.1（C-4），164.7（C-2），163.0（C-7），161.4（C-5），157.1（C-9），150.1（C-4′），145.9（C-3′），121.5（C-1′），119.4（C-6′），116.3（C-5′），113.7（C-2′），105.5（C-10），103.3（C-3），100.7（Gly-1），100.0（C-6），95.0（C-8），76.4（Gly-5），75.7（Gly-3），73.3（Gly-2），69.7（Gly-4），66.2（Gly-6）. 99.7（Rha-1），70.3（Rha-2），70.9（Rha-3），72.2（Rha-4），68.5（Rha-5）18.0（Rha-6）。TOF MS ESI（+）m/z：617.146 4［M+Na］+，449.106 6［M-146+

H］+，287.055 0［M-146-162+H］+；TOFMS ESI（-）m/z：593.152 7［M-H］-，285.041 4［M-146-162-H］-，（calc for C27H30O15），與文獻(xiàn) ［7，15］一致。

3 含有量測(cè)定

3.1 色譜條件 流動(dòng)相為0.5%醋酸-乙腈水溶液（50∶50）；體積流量 1.0 m L/m in；柱溫 30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm［1］。

3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木犀草素0.020 2 g、木犀草苷0.021 5 g、地奧司明0.019 8 g，置于50 mL量瓶中，加DMSO 5 mL溶解，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。再精密吸取10 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含木犀草素40.4μg、木犀草苷43.0μg、地奧司明對(duì)照品39.6μg的混合對(duì)照品溶液。

3.3 樣品溶液的制備 取木犀草素-7-0-蕓香糖樣品0.043 4 g，置于50 m L量瓶中，加DMSO 5 mL溶解，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。再精密吸取10 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含木犀草素-7-0-蕓香糖86.8μg的樣品溶液。

3.4 樣品測(cè)定 分別取混合對(duì)照品和供試品溶液10μL，進(jìn)樣分析，木犀草素-7-0-蕓香糖樣品HPLC圖見圖4，地奧司明、木犀草苷、木犀草素對(duì)照品HPLC圖見圖5。

圖4 木犀草素-7-O-蕓香糖樣品HPLC圖

圖5 地奧司明、木犀草苷、木犀草素對(duì)照品HPLC圖

3.5 含有量計(jì)算 樣品收率=21.7 g/33.0 g×100%= 65.7%；樣品含有量=測(cè)得樣品量/取樣量×100%=（C樣×V樣）/W樣×100%，其中C樣=A樣×C對(duì)/A對(duì)，C對(duì)= W對(duì)/V對(duì)，且V對(duì)=V樣，故樣品含有量（g/kg）=（W對(duì)× A樣/A對(duì)）/W樣×100%×1 000；木犀草素含有量=（0.020 2 g×8.4/102.4）/0.043 4 g×100%×1 000=38.2 g/kg；木犀草苷含有量=（0.021 5 g×11.7/77.3）/0.043 4 g× 100%×1 000=75.0 g/kg；地奧司明含有量=（0.019 8 g× 90%×13.6/68.4）/0.043 4 g×100%×1 000=80.4 g/kg；木犀草素-7-0-蕓香糖苷含有量=1 000-木犀草素含有量-木犀草苷含有量-地奧司明含有量=1 000-38.2-75.0-80.4=806.4 g/kg。

4 討論

目前在糖苷類脫甲基文獻(xiàn)中，僅葛根素的全合成使用了較昂貴的乙腈和三甲基碘硅烷［16］分別作為溶劑和脫甲基試劑，而碳苷穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于氧苷，故氧苷脫甲基文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。究其原因在于，氧苷的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于酚甲醚，遇酸易水解，遇熱易脫水，用現(xiàn)有方法對(duì)氧苷甲醚脫甲基，得到的產(chǎn)物是先脫糖，再脫甲基，最后得到苷元。在高溫下時(shí)，糖環(huán)甚至可能脫水，與黃酮母核進(jìn)行反應(yīng)，其產(chǎn)物較為復(fù)雜，難以得到先脫甲基而保留糖環(huán)的酚苷。本實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了氧苷脫甲基，也為其它相關(guān)研究提供了一種思路。

之前，曾用地奧明直接脫甲基，但其在醇和吡啶中與AlCl3絡(luò)合溶解的速度很慢，形成均勻溶液的難度較高，脫甲基效果不理想。同樣，橙皮苷在醇和吡啶中與AlCl3絡(luò)合后脫甲基的產(chǎn)率很低，經(jīng)密閉長(zhǎng)時(shí)間蒸餾，主要為脫糖產(chǎn)物，甲醇被逐漸蒸出，與黃酮絡(luò)合的鋁失去甲醇，進(jìn)而與B環(huán)上4′-OCH3和3′-OH形成絡(luò)合物，增強(qiáng)了4′-OCH3的碳離子正電性。反應(yīng)過程中產(chǎn)生的碘離子可極化性大，優(yōu)先進(jìn)攻4′-OCH3，使其脫甲基條件較為溫和，具體反應(yīng)機(jī)理見圖6。

另外還發(fā)現(xiàn)，在密閉蒸餾時(shí)，蒸餾溫度過高會(huì)導(dǎo)致糖苷脫水，而蒸餾時(shí)間過長(zhǎng)并且分子中含有糖時(shí)，會(huì)導(dǎo)致脫糖產(chǎn)物增加。三氯化鋁用量和橙皮苷的摩爾比為1∶1較好，三氯化鋁用量太少，則不能形成均一溶液；用量過多，脫糖產(chǎn)物增多，脫甲基產(chǎn)物并不能明顯增加。在脫鋁劑硫酸、鹽酸、枸櫞酸、酒石酸、磷酸、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉中，磷酸效果最好，并且磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉效果也好于鹽酸、硫酸等。

吡啶與甲醇、酚羥基、糖環(huán)上羥基形成氫鍵，與氫碘酸、鋁離子形成鹽，增大了相應(yīng)溶劑的沸點(diǎn)。如甲醇與甲醇之間形成氫鍵，沸點(diǎn)在65℃，但與吡啶形成氫鍵時(shí)，在80～90℃下甲醇仍不能沸騰，蒸發(fā)速度極慢。另外，吡啶與糖環(huán)、鋁鹽、氫離子形成的作用力也增加了吡啶的沸點(diǎn)，在120℃下蒸發(fā)的速度也非常緩慢，可用空氣冷凝，以減少冷凝水用量。吡啶和甲醇、糖環(huán)上羥基、酚羥基形成氫鍵的過程見圖7。

圖6 反應(yīng)機(jī)理

圖7 氫鍵形成過程

由于木犀草素-7-0-蕓香糖苷的對(duì)照品尚未上市，故無法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的含有量測(cè)定，只能測(cè)定其中地奧司明、木犀草素、木犀草苷的含有量，再扣除雜質(zhì)成分的含有量，進(jìn)而估算木犀草素的-7-0-蕓香糖苷的含有量。由于木犀草素、木犀草苷、木犀草素-7-0-蕓香糖苷的極性相差較大，并且在350 nm處都有最大吸收，而地奧司明在345 nm處也有最大吸收，接近350 nm，故采用藥典 “金銀花”項(xiàng)下木犀草苷含有量條件，將原來的梯度洗脫改為等度洗脫，并加大乙腈濃度，縮短測(cè)定時(shí)間。由于木犀草素-7-0-蕓香糖苷的準(zhǔn)確測(cè)定需要相關(guān)對(duì)照品，故本課題組將進(jìn)一步分離木犀草素-7-0-蕓香糖苷純品，為制備該對(duì)照品奠定基礎(chǔ)。

橙皮苷半合成木犀草素-7-0-蕓香糖苷僅需一步法即可完成，與利用橙皮苷半合成木犀草素-7-0-葡萄糖苷相比，步驟少，收率高，而且其水溶性高于后者，故可應(yīng)用于食品、藥品抗氧劑、抗菌劑，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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2014-09-03

聞?dòng)琅e （1979—），男，講師，研究方向?yàn)榛钚猿煞值奶崛?、分離、結(jié)構(gòu)修飾及全合成。Tel：13766434211，E-mail：ycxywyj@163.com