FSHβ基因-211G→T多態(tài)性與多囊卵巢綜合征的相關(guān)性研究

宋倩倩，楊夢(mèng)云，趙學(xué)科，邱慧玲

多囊卵巢綜合征(polysistic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見的異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病，發(fā)病率5% ～10%［1］。PCOS臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，如月經(jīng)稀發(fā)甚至閉經(jīng)、無排卵、高雄激素血癥、胰島素抵抗等，其并發(fā)癥也表現(xiàn)各異，不僅2型糖尿病、糖耐量受損及代謝綜合征的發(fā)生率較高［2-3］，而且子宮內(nèi)膜癌、妊娠及新生兒并發(fā)癥、心血管病等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也高于正常人群［4-6］，PCOS的病因至今尚未闡明?；蚨鄳B(tài)性研究是近年來學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PCOS的發(fā)病可能與基因調(diào)控有關(guān)。卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)由α和β亞基組成，β亞基具有特異性并使FSH具有生物活性，由卵泡刺激素β亞基(follicle stimulating hormone β-subunit，F(xiàn)SHβ)基因編碼，F(xiàn)SH 對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育及排卵以及雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素起到重要的作用。而PCOS患者內(nèi)分泌特征有:雄激素過多、雌激素過多、黃體生成素與卵泡刺激素比值(luteinizing hormone/follicle stimulating hormone，LH/FSH)增大等。因此，F(xiàn)SHβ基因是PCOS病因研究的相關(guān)因素，但目前尚缺乏FSHβ-211G→T與PCOS的相關(guān)性研究。本研究特探討FSHβ-211G→T與PCOS的關(guān)系如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 病例組:收集2013年3－8月就診于廈門解放軍174醫(yī)院婦科的18～35歲PCOS 100例，均為福建省漢族人，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003年歐洲人類生殖協(xié)會(huì)和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，即:①稀發(fā)排卵或無排卵;②雄激素水平升高的臨床表現(xiàn)和(或)高雄激素血癥;③B超監(jiān)測(cè)下的卵巢多囊改變，一側(cè)或雙側(cè)卵巢中直徑2～9 mm的卵泡數(shù)≥12個(gè)，和(或)單側(cè)卵巢體積增大＞10 mL;符合以上3條中的2條，并排除其他致雄激素水平升高的病因，包括先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素的腫瘤、庫(kù)欣綜合征等，以及其他引起排卵障礙的疾病，如高催乳素血癥、垂體或下丘腦性閉經(jīng)、卵巢早衰、甲狀腺功能異常等。對(duì)照組:選擇同期因輸卵管因素(慢性輸卵管炎)不孕而就診的女性154例，入選標(biāo)準(zhǔn)為:年齡18～35歲、福建省漢族人;月經(jīng)規(guī)律(25 d＜月經(jīng)周期＜35 d);B超監(jiān)測(cè)正常排卵;均無慢性疾病;至少3個(gè)月未服用過激素類藥物。本研究經(jīng)174醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得每位研究對(duì)象的知情，并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒(Roche公司)，DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，部分激素檢測(cè)試劑盒(瑞士 Roche公司);Unicel DXI 800化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套生殖激素檢測(cè)試劑(BECKMAN COULTER公司)，Bioer lifepro PCR擴(kuò)增儀(北京東方安諾生化科技有限公司)，Cavoy電泳儀(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)，ABI3730測(cè)序儀(廈門閩博生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 收集入選對(duì)象的年齡、血壓、腹圍、身高、體重、體質(zhì)指數(shù)、月經(jīng)史及B超監(jiān)測(cè)排卵情況。所有入選對(duì)象至少3個(gè)月未服用過激素類藥物，均于月經(jīng)來潮第2～3天(閉經(jīng)者任何時(shí)期)，禁食12 h，抽取靜脈血，檢測(cè)血清FSH、LH、雌二醇(estradiol，E2)、孕激素(progesterone，P)、睪酮(testosterone，T)、泌乳素(prolactin，PRL)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，以及空腹總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL)、血清硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS)、性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)。以穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)［8］(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。并于同樣條件下各抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，于－80℃儲(chǔ)存。

提取全血DNA，PCR總反應(yīng)體積20 μL，上下游引物(l1 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板 4 μL、超純水9.4 μL、10 × Easytaq Buffer 2 μL、2.5 mM dNTPs 2 μL、Easytaq DNA Polymerase 0.6 μL;FSHβ-211G→T基因引物序列［英濰捷基(上海)有限公司合成］:上游引物為:5'-GGTAGTGATTATGGTTCTCCCTCAC-3'，下游引物為:5'-CCACTTGAAAACGGTAGATGC-3'。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次，72℃最后延伸5 min，擴(kuò)增結(jié)束后存于4℃。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 2 μL，在瓊脂糖凝膠(1.2%)上，用穩(wěn)壓100 V，電泳15 min，于凝膠成像分析儀上成像，進(jìn)行基因測(cè)序，獲得突變位點(diǎn)基因序列，與已獲取的基因序列比對(duì)后，根據(jù)測(cè)序圖進(jìn)行基因型鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料組間比較若符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布則采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例(率)［n(%)］表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果 PCR擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)811 bp，于凝膠成像分析儀上成像見圖1?；驕y(cè)序結(jié)果示FSHβ-211G→T基因變異有兩個(gè)基因型G/G及G/T(圖2)。

圖1 FSHβ-211G→T基因PCR產(chǎn)物凝膠成像

圖2 病例組和對(duì)照組FSHβ-211G→T基因測(cè)序結(jié)果

2.2 病例組和對(duì)照組的FSHβ-211G→T的基因型及等位基因分布 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)［9］，兩組等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。在PCOS人群中FSHβ-211G→T突變 GT基因型頻率為14.0%，對(duì)照組中 GT基因型頻率為6.5%，F(xiàn)SHβ-211G→T的基因型在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，表1)。

表1 兩組的FSHβ-211G→T的基因型及等位基因分布比較

2.3 不同F(xiàn)SHβ-211G→T基因型對(duì)病例組及對(duì)照組內(nèi)分泌代謝指標(biāo)的影響 攜帶GT基因型的患者較GG基因型患者具有低FSH水平及高LH/FSH比值(P＜0.05);同時(shí)在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)具有GT基因型者較GG基因型者具有高LH/FSH比值及高TC水平(P ＜0.05，表 2)。

3 討論

PCOS是育齡期婦女一種常見的異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病，臨床表現(xiàn)及近遠(yuǎn)期并發(fā)癥復(fù)雜多樣［2-6］，嚴(yán)重影響女性生殖及內(nèi)分泌健康。但PCOS的病因至今尚未闡明，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PCOS的發(fā)病可能與基因調(diào)控有關(guān)。人體內(nèi)基因具有自然變異和多態(tài)性的特征，基因?qū)W研究有助于了解人類復(fù)雜疾病。最近被確認(rèn)的FSHβ-211G→T，位于FSHβ基因啟動(dòng)子區(qū)的第 211 個(gè)位點(diǎn)(rs10835638)［10］。有研究［11-12］表明，F(xiàn)SHβ-211G→T對(duì)生育期女性的下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic pituitary ovarian axis，HPO)有一定的影響，F(xiàn)SHβ基因和FSH受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)基因聯(lián)合突變可能會(huì)影響血清FSH水平。有研究［13］認(rèn)為女性HPO軸有影響的基因變異對(duì)PCOS的相關(guān)表型也有一定的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)FSHβ-211G→T基因變異具有兩個(gè)基因型GG及GT，在PCOS人群中FSHβ-211G→T突變GT基因型頻率為14.0%，T等位基因頻率高于對(duì)照組(PCOS為7.0%，對(duì)照組為 3.2%)，兩組間FSHβ-211G→T基因型分布存在差異(P＜0.05)，表明該單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)PCOS的發(fā)病易感性有影響，并明確了FSHβ-211G→T基因多態(tài)性對(duì)PCOS的內(nèi)分泌代謝有一定的影響。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［12］，F(xiàn)SHβ-211G→T突變基因T與高FSH水平及高LH水平相關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ-211G→T與血清FSH水平之間的關(guān)系明顯不同于先前的研究，這可能與不同人種、不同地區(qū)群體的基因突變頻率差異及研究設(shè)計(jì)方案、分析方法的不同有關(guān)。在PCOS患者中FSHβ-211G→T多態(tài)性對(duì) FSH及LH/FSH比值有影響，攜帶GT基因型的患者較GG基因型患者具有低FSH水平及高LH/FSH比值(P＜0.05)，同時(shí)TC水平也有上升趨勢(shì);在對(duì)照組中攜帶GT基因型者較GG基因型者具有高LH/FSH比值及高TC水平(P＜0.05)，而FSH水平也有下降趨勢(shì);該基因多態(tài)性對(duì) LH、FPG、FINS、LDL、HDL、DHEAS、SHBG等指標(biāo)無明顯影響。因此，筆者推斷FSHβ基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性通過影響FSH、TC水平來影響PCOS的內(nèi)分泌代謝。根據(jù)Falck在1959年提出的學(xué)說［14］:在顆粒細(xì)胞中，F(xiàn)SH與顆粒細(xì)胞上的FSHR結(jié)合，激活顆粒細(xì)胞內(nèi)的芳香化酶活性，將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。因此筆者推測(cè)，F(xiàn)SHβ-211G→T通過影響FSH水平，改變PCOS體內(nèi)雄激素和雌激素的水平，引起激素水平的紊亂，以致PCOS臨床內(nèi)分泌代謝的變化，最終導(dǎo)致PCOS的發(fā)生?？傊瓼SHβ-211G→T基因多態(tài)性對(duì)PCOS的發(fā)病易感性及臨床內(nèi)分泌特征有影響，F(xiàn)SHβ-211G→T基因多態(tài)性可能是PCOS發(fā)病的原因之一。

表2 病例組與對(duì)照組不同F(xiàn)SHβ-211G→T基因型的內(nèi)分泌代謝指標(biāo)比較(±s)

表2 病例組與對(duì)照組不同F(xiàn)SHβ-211G→T基因型的內(nèi)分泌代謝指標(biāo)比較(±s)

注:與本組GG基因型比較，*P＜0.05

指標(biāo) 病例組(n=100)對(duì)照組(n=154)GG GT FSH(mIU/mL) 6.77 ±1.93 5.18 ±1.41*GG GT 1.40 ±0.38 1.55 ±0.33 1.53 ±0.35 1.73 ±0.55 7.36 ±2.37 6.76 ±1.21 LH(mIU/mL) 10.78 ±6.53 11.91 ±6.85 4.37 ±1.99 7.45 ±7.20 LH/FSH 1.65 ±0.93 2.31 ±1.14* 0.65 ±0.37 1.06 ±0.87*E2(pg/mL) 39.98 ±21.45 35.71 ±18.67 39.99 ±24.06 40.40 ±19.46 T(ng/mL) 0.62 ±0.35 0.56 ±0.14 0.60 ±2.84 0.37 ±0.13 P(ng/mL) 0.91 ±0.72 0.79 ±0.40 1.18 ±2.59 0.85 ±0.30 PRL(ng/mL) 14.86 ±6.72 28.23 ±43.88 16.72 ±8.46 15.80 ±4.84 TSH(μIu/mL) 2.68 ±3.39 4.07 ±5.89 2.21 ±1.09 1.75 ±0.58 SHBG(nmol/L) 53.09 ±85.58 41.65 ±72.40 63.71 ±63.24 86.91 ±116.27 DHEAS(μg/dL) 306.95 ±60.34 321.50 ±63.67 308.41 ±138.31 326.52 ±113.69 FPG(mmol/L) 4.85 ±0.53 4.94 ±0.73 4.69 ±0.50 4.69 ±0.43 FINS(μU/mL) 11.27 ±6.75 13.08 ±8.88 8.31 ±7.82 8.16 ±3.50 HOMA-IR 2.44 ±1.64 2.88 ±2.50 1.76 ±1.69 1.71 ±0.78 TC(mmol/L) 4.74 ±0.77 5.17 ±0.85 4.86 ±0.79 5.43 ±0.75*TG(mmol/L) 1.76 ±4.30 1.34 ±4.32 0.98 ±0.74 0.96 ±0.70 LDL(mmol/L) 2.83 ±0.71 3.07 ±0.71 2.87 ±0.05 3.17 ±0.77 HDL(mmol/L)

本研究對(duì)FSHβ-211G→T與PCOS的相關(guān)性進(jìn)行首次研究，選取的人群僅為中國(guó)福建漢族女性人群，具有一定的局限性，有待對(duì)更多地區(qū)、更多人種進(jìn)行研究。

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