李 研，郝乘儀，李曉光

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林 132013)

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化西南石韋中總黃酮的提取工藝

李 研，郝乘儀，李曉光*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林 132013)

目的 優(yōu)選西南石韋總黃酮的最佳提取工藝。方法 以乙醇為溶劑采用索氏提取法提取總黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)考察提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，并用分光光度計(jì)法測(cè)定其含量。結(jié)果 西南石韋總黃酮的最佳提取工藝條件為溫度:100℃;提取時(shí)間: 5 h;乙醇濃度:80%;料液比:1∶30。在此條件下，總黃酮提取率達(dá)到4.02%。結(jié)論 該提取工藝穩(wěn)定可靠，成本低，操作簡(jiǎn)便，總黃酮提取率較高，可作為西南石韋中總黃酮的最佳提取工藝。

西南石韋;總黃酮;正交設(shè)計(jì);提取工藝

西南石韋，Pyrrosia gralla(Gies.)Ching，又名長(zhǎng)柄石韋，扁擔(dān)草，分布于湖北、四川、云南。有鎮(zhèn)咳、祛痰，抗菌、抗病毒作用，對(duì)于化學(xué)療法及放射線療法引起的白細(xì)胞下降，石韋有使其升高的作用［1］。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)西南石韋的研究主要集中在分類(lèi)、結(jié)構(gòu)和組織培養(yǎng)上［2］，對(duì)西南石韋中總黃酮的提取工藝研究很少，對(duì)其藥理作用的研究更少。本研究旨在找到提取西南石韋中總黃酮的可行工藝，探究不同影響因素下提取液中總黃酮的提取率，從而找出提取西南石韋中總黃酮的最佳提取工藝。

1 試藥與儀器

西南石韋采于貴州遵義鳳凰山脈，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室李景華副教授鑒定為水龍骨科石韋屬植物西南石韋的全草。將藥材洗凈，陰干后，剪碎備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98.0%，上海源葉生物科技有限公司);氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇等均為分析純。

UV-1800型紫外分光光度計(jì)［日本島津(shimadzu)公司］;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司);DH-98-LLA型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);202-2AB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);FA1104N型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);SYP型智能玻璃恒溫水浴(上海大研儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［3］。精密稱定5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加95%乙醇至5 mL，分別加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min。再分別加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，蒸餾水稀釋至10 mL，放置20 min后，以試劑空白作參比溶液，用分光光度計(jì)法在494 nm波長(zhǎng)測(cè)得其吸光度值分別為0.133、0.232、0.330、0.429、0.527，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=9.848 6C+0.035，r=0.999 3。結(jié)果表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 西南石韋中總黃酮的含量測(cè)定

精密稱取3g西南石韋藥材，置于索氏提取器中，用乙醇水浴提取，趁熱抽濾，洗滌濾渣，提取液在水浴中濃縮至25 mL并同時(shí)回收乙醇。將定容至25 mL的提取液，取1 mL于25 mL容量瓶中，加入95%乙醇4.0 mL，按2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總黃酮的提取率。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察溫度、時(shí)間、濃度、料液比4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響，選擇每個(gè)因素下的3個(gè)水平，用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選。

2.3.1 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

選擇溶劑為80%乙醇60mL，提取時(shí)間為2 h，考察提取溫度80、85、90、95、100℃時(shí)對(duì)總黃酮提取率的影響，提取率為1.17%、1.55%、1.76%、1.97%和1.88%。結(jié)果表明溫度對(duì)總黃酮提取率的影響較大，在一定溫度范圍內(nèi)提取率隨溫度的升高而呈上升趨勢(shì)，95℃時(shí)提取率最高，溫度繼續(xù)上升對(duì)總黃酮的提取率影響下降。因此選擇95℃作為下一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的提取條件，選取90、95、100℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

選取溶劑為80%乙醇60 mL，將溫度控制在95℃，考察不同提取時(shí)間:2、3、4、5、6 h對(duì)總黃酮提取率的影響，提取率為1.90%、2.14%、2.39%、2.30%、2.06%。結(jié)果表明4 h為最佳提取時(shí)間。隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率下降，因?yàn)辄S酮類(lèi)物質(zhì)被氧化破壞導(dǎo)致總黃酮提取率不再增加甚至下降。因此，從節(jié)約能源考慮，選取4 h作為下一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)條件，并選取3、4、5 h作為正交試驗(yàn)條件。

2.3.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

將溫度控制在95℃，提取時(shí)間為4 h，溶劑用量60 mL，考察不同乙醇濃度:75%、80%、85%、90%、95%的乙醇對(duì)提取率的影響，提取率為2.21%、2.56%、2.63%、2.49%、2.35%。結(jié)果總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而增加，85%乙醇最利于總黃酮的溶出，隨乙醇濃度增大，總黃酮提取率反而呈下降趨勢(shì)。因此用85%乙醇作為下一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的提取條件，并選取80%、85%、90%的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

溶劑為85%的乙醇，溫度為95℃，提取時(shí)間為4 h，考察不同料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40對(duì)總黃酮提取率的影響。提取率為 2.72%、3.52%、3.99%、3.87%、3.82%。結(jié)果表明總黃酮提取率隨料液比的增大呈明顯上升趨勢(shì)，1∶30已將有效成分基本溶出完全，再增加料液比總黃酮提取率基本趨于穩(wěn)定，綜合考慮提取效果，經(jīng)濟(jì)及提取液濃縮難易，因此，選取3個(gè)較佳的料液比分別為1∶25，1∶30，1∶35進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為優(yōu)化提取工藝條件，選取4個(gè)主要影響因素:提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、料液比(D)。利用L9(34)正交表(表1)進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，從表2可知，各因素對(duì)總黃酮提取率影響的主次順序?yàn)?提取時(shí)間＞料液比＞乙醇濃度＞提取溫度。最佳提取條件為A3B3C1D2，即提取溫度:100℃，提取時(shí)間:5 h，乙醇濃度:80%，料液比:1∶30。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

精密稱取一定量藥材，在最佳條件下操作，平行制備3份樣品溶液，每份測(cè)定3次，取其平均值，結(jié)果提取率為4.02%?？梢钥闯?，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取條件下，總黃酮提取率高于正交表中9次實(shí)驗(yàn)中的任一值，故可以確定為最佳提取工藝條件。

表1 L9(34)設(shè)計(jì)因素水平表

表2 實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3 討論

本研究采用索氏提取法提取西南石韋中的總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝，確定最佳提取工藝為:將3 g西南石韋置于索氏提取器中，加入80%乙醇90 mL，100℃水浴提取5 h，趁熱抽濾，洗滌濾渣，提取液在水浴中濃縮并同時(shí)回收乙醇。該工藝采用乙醇為溶劑具有成本低，回收乙醇不僅經(jīng)濟(jì)且污染小。采用索氏提取器，操作簡(jiǎn)便，乙醇用量少，浸提效果好，工藝簡(jiǎn)單，是較好的提取方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該提取工藝穩(wěn)定性好，總黃酮提取率高，適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］ 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草:第二冊(cè)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:254-257.

［2］ 陳露，劉布鳴，馬軍花，等.中藥石韋的研究概況［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2011，33(11):1486-1489.

［3］ 阿衣木姑·阿布拉，蘇力坦·阿巴白克力.天山瓦韋總黃酮成分的含量測(cè)定［J］.生物技術(shù)，2007，17(4):66-67.

Optim ization of the extraction process of flavonoids in Pyrrosia gralla by orthogonal design

LIYan，HAO Chengyi，LIXiaoguang*
(Department of Pharmacy，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

Objective To optimize the extraction technology of flavonoids from Pyrrosia gralla.Methods Extract flavonoids from Pyrrosia gralla by Soxhletextraction with ethanol as solvent.Based on single factor test，orthogonal test was adopted to optimize extraction technology by taking extraction temperature，extraction time，ethanol concentration and solid-liquid ratio as factors.UV was used to determined the content of flavonoids from Pyrrosia gralla.Results ptimum extraction technology was as followng:extracted 5 h with 30 times，the amount of 80%ethanol，liquid to solid ratio:1∶30 at 100℃.Extraction rate of total flavonoids was up to 4.02%on this condition.Conclusion This method is stable，economical，easy and higher extraction rate and can be used as the best extraction for Pyrrosia gralla.

Pyrrosia gralla;flavonoids;orthogonal design;extraction

R284.2

A

1673-2995(2015)01-0004-03

2014-09-04)

李 研(1978－)，女(漢族)，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科.

李曉光(1963－)，女(漢族)，教授，本科.