齊 欣 ，李 明 ，王延波 ，馬 駿 ，劉欣芳 ，姜 敏 ，楊佳穎

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，遼寧沈陽(yáng) 110161；2.遼寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)療學(xué)院，遼寧錦州 121013）

草甘膦是世界上使用面積和銷量最大的化學(xué)除草劑，抗草甘膦玉米是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中推廣和應(yīng)用最成功的案例之一，其幾乎覆蓋所有允許種植轉(zhuǎn)基因玉米國(guó)家的玉米種植地區(qū)，且種植面積年年增加。2012年，全球玉米種植面積為1.75億hm2，轉(zhuǎn)基因玉米品種種植面積占其中的35%[1]，其中多數(shù)為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米或含有抗草甘膦基因的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米。2014年，我國(guó)玉米種植面積達(dá)到3 690萬(wàn)hm2，草甘膦使用和出口量已達(dá)到全世界草甘膦市場(chǎng)總量的20%。我國(guó)正逐步放開對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米種植的限制，而目前在全世界范圍內(nèi)種植的抗草甘膦作物均為國(guó)外專利品種，一些具有壟斷地位的跨國(guó)公司正積極的申請(qǐng)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米在中國(guó)的商業(yè)推廣。及時(shí)研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗除草劑基因及其玉米品種，才會(huì)使我國(guó)的玉米產(chǎn)業(yè)體系免遭毀滅性打擊。

1 草甘膦研究與應(yīng)用

草甘膦（Glyphosate）是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的競(jìng)爭(zhēng)類似物，通過(guò)植物地上綠色莖葉角質(zhì)層吸收后，隨光合作用產(chǎn)物從韌皮部快速傳導(dǎo)至整個(gè)植株的各個(gè)部位，可防除單子葉和雙子葉、一年生和多年生、草本和灌木等40多科的植物。因其本身廣譜、內(nèi)吸傳導(dǎo)式、低毒、低殘留、可混性強(qiáng)、價(jià)格合理、獨(dú)特的靶標(biāo)和作用機(jī)理等自身優(yōu)點(diǎn)，自孟山都公司開發(fā)生產(chǎn)推向市場(chǎng)，草甘膦得到迅速的推廣應(yīng)用。2005年，全世界草甘膦銷售量為35萬(wàn)t；2012全球草甘膦銷售量為71.86萬(wàn)t，銷售額為54.6億美元，2014年全球用量已達(dá)80萬(wàn)t以上，預(yù)計(jì)2020年約需100萬(wàn)～120萬(wàn)t。2014年，我國(guó)草甘膦農(nóng)藥登記為806個(gè)，其中以原藥登記的多達(dá)147個(gè)。2014年，我國(guó)草甘膦生產(chǎn)量占世界總量50%以上，達(dá)到39萬(wàn)t。

在植物體內(nèi)其占據(jù)5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸酯合成酶（EPSPS）的第2個(gè)底物PEP的結(jié)合位點(diǎn)與莽草酸-3-磷酸（S3P）、EPSPS合成為 EPSP-S3P-草甘膦復(fù)合體，競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸代謝途徑中關(guān)鍵酶EPSPS（該酶廣泛存在于植物的葉綠體中）活性[2]，導(dǎo)致S3P不能有效地轉(zhuǎn)化為5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸（EPSP），造成：①大量的碳流向S3P，莽草酸大量積累，產(chǎn)生毒性；②植株能量損耗加?。阜肿覵3P的積累消耗1分子PEP和1分子ATP）；③抑制芳香族氨基酸化合物（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成及次生產(chǎn)物若干代謝反應(yīng)失調(diào)，從而導(dǎo)致植株失綠死亡。其作用靶點(diǎn)有3個(gè)：質(zhì)體EPSP合成酶、胞質(zhì)EPSP合成酶以及胞質(zhì)3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸合成酶。

2 抗草甘膦玉米研究

EPSPS存在于高等植物和微生物體內(nèi)[3-5]，是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是草甘膦在細(xì)胞內(nèi)的唯一靶標(biāo)[6]。在植物細(xì)胞中，EPSPS基因存在于細(xì)胞核中，但成熟蛋白位于葉綠體內(nèi)，而且EPSPS也只有在葉綠體中與其他莽草酸途徑的成員共同作用才能合成芳香族氨基酸，信號(hào)肽位于EPSPS前體的N端，其對(duì)EPSPS前體正確定位到細(xì)胞葉綠體起到重要作用。植物EPSPS成熟酶的序列相似性很高，而葉綠體信號(hào)肽序列的相似性卻較低，來(lái)源于植物的EPSPS與來(lái)源于細(xì)菌的EPSPS相似性高于真菌的EPSPS[7-11]。

2.1 細(xì)胞與組織培養(yǎng)方法

在細(xì)胞與組織培養(yǎng)基中逐步提高草甘膦的濃度，選擇耐草甘膦突變體，通過(guò)提高自身EPSPS活性，從而產(chǎn)生高抗草甘膦作物品種。Smart等[12]發(fā)現(xiàn)在添加5mM草甘膦的植物培養(yǎng)基中常綠紫堇細(xì)胞EPSPS的活性提高40倍；Widholm等[13]通過(guò)長(zhǎng)期不斷提高細(xì)胞培養(yǎng)基中草甘膦濃度，使得苜眷、大豆、煙草3種植物細(xì)胞的EPSPS活性分別提高了62、21和800倍，并發(fā)現(xiàn)EPSPS基因的拷貝數(shù)和mRNA水平均升高了很多。祝水金等[14]采用體細(xì)胞培養(yǎng)獲得抗草甘膦的棉花突變體，其草甘膦抗性為單基因顯性遺傳，雜交后代仍具有抗草甘膦的特性。趙錦慧[15]利用體細(xì)胞篩選法進(jìn)行抗草甘膦突變體的篩選，篩選得到在細(xì)胞水平上能抗0.5 mL/L草甘膦、植株水平上抗0.9 mL/L草甘膦的突變體。但至今為止還沒(méi)有關(guān)于玉米品種選育研究成功的報(bào)道。

自然界草甘膦抗性發(fā)展的速度依賴于有機(jī)體繁殖時(shí)間和基因復(fù)制的穩(wěn)定性，而高等植物之所以在自然情況下產(chǎn)生對(duì)草甘膦的抗性幾率很低，是由于其相對(duì)高的復(fù)制穩(wěn)定性以及繁殖一代的時(shí)間較長(zhǎng)。所以，Padgette等[16]認(rèn)為實(shí)驗(yàn)室模擬草甘膦環(huán)境篩選抗性植株突變體的效率很低，要想取得成果是很困難。

2.2 轉(zhuǎn)基因方法

2.2.1 基于對(duì)EPSPS基因的修飾。對(duì)EPSPS基因的修飾策略有2個(gè)，一種是植株體內(nèi)EPSPS過(guò)量表達(dá)，進(jìn)而增加對(duì)一定劑量草甘膦的耐受性。Rogers等[17]在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入攜帶具有抗草甘膦大腸桿菌中aroA基因的多拷貝質(zhì)粒，細(xì)胞EPSPS表達(dá)量約為原來(lái)5～17倍，并表現(xiàn)出至少8倍的耐受草甘膦能力；Klee、Shah等[8，18]利用椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子分別在擬南芥和牽牛花中過(guò)量表達(dá)EPSPS，使轉(zhuǎn)基因的植株、愈傷組織和細(xì)胞都提高了對(duì)草甘膦的耐受能力；通過(guò)EPSPS基因的過(guò)量表達(dá)，提供充足的酶活性滿足生物合成代謝的需要，從而維持了植物正常的生理代謝活動(dòng)；但多拷貝地轉(zhuǎn)入外源基因有可能造成轉(zhuǎn)入的基因沉默和抑制，也造成植物體內(nèi)草甘膦的累積，使植物正常生長(zhǎng)受到改變或抑制[19]，而且這種抗性不足以滿足商業(yè)化使用的要求[18]，目前，通過(guò)EPSPS過(guò)量表達(dá)策略還未能獲得可以在生產(chǎn)上應(yīng)用的抗草甘膦作物。

另一策略是植株導(dǎo)入經(jīng)過(guò)修飾后具有草甘膦抗性的EPSPS，使其合成與草甘膦親和性下降的EPSPS，從而提高植株草甘膦耐受性。Comai等[20]首次從抗草甘膦的鼠傷寒沙門菌中克隆出一個(gè)由于氨基酸突變而獲得抗性的aroA基因，并將這個(gè)突變的基因轉(zhuǎn)到煙草中進(jìn)行表達(dá)，獲得了對(duì)草甘膦具有抗性的轉(zhuǎn)基因煙草。Padgette[16]通過(guò)對(duì)多種來(lái)源EPSPS基因的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和植物的EPSPS都擁有一段高度保守區(qū)域LXLGNAGTAXRXL（X為不保守的氨基酸），并且保守區(qū)域的氨基酸突變?yōu)楸彼岷蛯⒏彼嵬蛔優(yōu)榻z氨酸時(shí)，EPSPS雖與PEP的親和性下降，但與草甘膦的親和性下降的更多，從而提高對(duì)草甘膦的抗性。隨后，一些學(xué)者利用各種手段從抗草甘膦植物和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)克隆出許多通過(guò)EPSPS上氨基酸位點(diǎn)突變，改造出許多具有增強(qiáng)草甘膦抗性的EPSPS[11，21-24]。

Lebrun等[25]對(duì)一種玉米的EPSPS基因定向誘變2個(gè)氨基酸，突變后的EPSPS對(duì)草甘膦產(chǎn)生了很高的抗性，第1代轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米GA21轉(zhuǎn)入的就是該突變基因。但由于其所有權(quán)存在爭(zhēng)議，沒(méi)有得到充分推廣。目前，來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌CP4菌株的EPSPS對(duì)PEP的親和性較好，且高抗草甘膦[26]，是使用范圍最廣且轉(zhuǎn)入作物中最多的抗性基因，據(jù)ISAAA網(wǎng)站資料顯示，商業(yè)化利用ep4-epsps的抗草甘膦玉米品種有 MON801，MON802，MON809，MON810，NK603，MON832，MON87427，MON88017，其中NK603是獲得最多國(guó)家批準(zhǔn)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物品種。這是現(xiàn)在獲得對(duì)草甘膦抗性的最主要方法之一。

2.2.2 轉(zhuǎn)入能夠消除草甘膦毒性的基因。與犧牲EPSPS和PEP結(jié)合催化活性為代價(jià)而獲得對(duì)草甘膦抗性不同，轉(zhuǎn)入能夠消除草甘膦毒性的基因，在草甘膦發(fā)生作用前將其降解或解毒，使植物獲得抗草甘膦功能。

目前，發(fā)現(xiàn)的降解草甘膦基因有從人蒼白桿菌菌株LBAA中克隆出草甘膦氧化還原酶gox[27]，從一株高效降解草甘膦的類鼻疽假單胞菌中克隆到glpA和glp[26]，從地衣芽胞桿菌中克隆的編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）的代謝基因 gat[28]、美國(guó)專利（20070107078）中報(bào)告的編碼同源脫羧酶基因GDC-1和GDC-2細(xì)菌酶。據(jù)ISAAA網(wǎng)站資料顯示，商業(yè)化推廣的抗草甘膦玉米中利用gat4621的有78140， 利 用 goxv247 的 有 MON801，MON802，MON809，MON810，MON832。尋找和挖掘能夠降解或解毒草甘膦的相關(guān)酶基因，進(jìn)而培育出抗草甘膦作物，原理簡(jiǎn)單明確，是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因育種的另一條有效途徑。

國(guó)內(nèi)學(xué)者在抗草甘膦植物、細(xì)菌的分離篩選，抗草甘膦基因的克隆，細(xì)菌水平和作物水平基因驗(yàn)證，基因高效表達(dá)體系構(gòu)建以及抗草甘膦玉米選育等方面進(jìn)行了大量的研究，取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。截止2012年底我國(guó)注冊(cè)批準(zhǔn)的有關(guān)抗草甘膦專利有25項(xiàng)，國(guó)內(nèi)單位及個(gè)人的占17項(xiàng)，其中15項(xiàng)是與抗草甘膦基因有關(guān)，2項(xiàng)與降解草甘膦的gat基因有關(guān)；正在審查中與抗草甘膦的有關(guān)專利為38項(xiàng)，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)22項(xiàng)；其他均為國(guó)外公司申請(qǐng)的專利。在已獲國(guó)內(nèi)專利的15個(gè)抗草甘膦基因有關(guān)抗性基因中2項(xiàng)來(lái)自水稻和苘麻，13項(xiàng)來(lái)自細(xì)菌，其中來(lái)自假單胞菌屬的基因有8項(xiàng)。目前，只有林敏實(shí)驗(yàn)室的G2-epsps基因轉(zhuǎn)讓給國(guó)內(nèi)奧瑞金公司進(jìn)行商業(yè)開發(fā)。

2.3 生物和非生物逆境

在自然界中，同一物種不同株系間抗草甘膦能力存在遺傳差異。通過(guò)生物和非生物逆境手段，篩選抗草甘膦突變單株或株系，再利用雜交、回交和分子輔助選擇等手段選育抗草甘膦作物。陶波等[29]利用田間試驗(yàn)及生化分析的方法，對(duì)66份菜豆品種（系）進(jìn)行抗草甘膦篩選，發(fā)現(xiàn)芳香族氨基酸含量高的品系具有較強(qiáng)的大田草甘膦抗性。呂曉波[30]利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）和疊氮化鈉，對(duì)6個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的大豆品種進(jìn)行種子處理。沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)的魏松紅等[31]應(yīng)用紫外線和疊氮化鈉對(duì)小麥種子進(jìn)行誘變，獲得抗草甘膦的小麥植株。

因植物基因穩(wěn)定性及繁殖時(shí)間，這種方法前期需要長(zhǎng)時(shí)間，大量的工作才能獲得抗草甘膦突變單株或株系。但這種方法在轉(zhuǎn)基因作物沒(méi)有批準(zhǔn)釋放的國(guó)家，選育的抗草甘膦品種能規(guī)避國(guó)家轉(zhuǎn)基因政策，且通過(guò)突變體可克隆出具有自主產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦基因，避免國(guó)家轉(zhuǎn)基因作物放開后，國(guó)外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)本國(guó)市場(chǎng)的沖擊。

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