王雪維(綜述)，李　燕(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，昆明 650031)

Bcl-2、Bax在青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中的研究進(jìn)展

王雪維△(綜述)，李燕※(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，昆明 650031)

摘要：青光眼為人類三大致盲性眼病之一，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡在視神經(jīng)損傷過程中扮演著重要角色，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡途徑及信號通路尚不完全清楚。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡調(diào)控的影響因子之一，參與青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程，Bcl-2/Bax的比例決定了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否走向死亡。該文就Bcl-2家族在青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中的作用機(jī)制及研究進(jìn)展予以綜述。

關(guān)鍵詞：青光眼；Bcl-2/Bax；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

青光眼是一組以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為特征的疾病，病理改變主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的減少及神經(jīng)軸突的丟失。以往研究認(rèn)為，青光眼視神經(jīng)損傷主要是由于眼內(nèi)壓升高，使軸漿阻滯于篩板區(qū)，軸突蛋白的生成和轉(zhuǎn)運(yùn)減少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失[1]。但近年研究發(fā)現(xiàn)，在正常眼壓型青光眼、青光眼術(shù)后眼壓控制良好的患者，即使眼壓不高于正常，視野丟失也沒有完全停止[2]。針對青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失機(jī)制的討論還在繼續(xù)，通過深入了解青光眼視神經(jīng)損傷的機(jī)制，將為臨床青光眼視神經(jīng)保護(hù)藥物的應(yīng)用提供依據(jù)。細(xì)胞凋亡受多種相關(guān)基因及其蛋白調(diào)控，Bc1-2家族的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[3]?，F(xiàn)就Bcl-2/Bax與青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制及國內(nèi)外研究進(jìn)展綜述如下。

1Bcl-2、Bax家族的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

1.1Bcl-2結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能抗凋亡蛋白 Bcl-2由239個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為25 000～26 000，位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等處。Bcl-2基因位于 18q21，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，可編碼26 000的Bcl-2α和22 000的Bcl-2β兩種蛋白，其中Bcl-2α是抑制凋亡作用發(fā)揮的主要蛋白，也是線粒體膜的整合蛋白[4]。拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)顯示，Bc1-2蛋白由7個 α螺旋緊密相連，2個疏水性長α螺旋組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其他5個α螺旋包圍在其四周，中心α螺旋(α5和α6)垂直方向插入脂質(zhì)雙層膜參與離子通道形成，通過離子通道調(diào)節(jié)鈣離子及蛋白質(zhì)分子的流通量，這個三維結(jié)構(gòu)是Bc1-2發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2還可通過蛋白與蛋白之間的復(fù)雜熱力作用進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。

Bcl-2主要通過以下途徑發(fā)揮抑制凋亡作用：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Bcl-2通過特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，控制離子通道開放，降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平，實驗證實通過轉(zhuǎn)基因Bcl-2高表達(dá)可使Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性降低，抑制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的跨膜流動[6]。②Bcl-2可維持氧化還原狀態(tài)及提高細(xì)胞的谷胱甘肽水平，線粒體上Bcl-2α蛋白為線粒體膜的整合蛋白，通過對抗線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)以控制其膜電位從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7]。Voehringer和Meyn[8]通過Bcl-2基因敲除的小鼠出現(xiàn)與暴露于慢性氧化應(yīng)激中的小鼠一致的表現(xiàn)，認(rèn)為Bcl-2在凋亡的起始階段發(fā)揮了抗氧化作用。③Bcl-2蛋白通過阻止Bax/Bak的寡聚化，控制線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔孔道復(fù)合體的開放，抑制線粒體細(xì)胞色素 C和凋亡誘導(dǎo)因子等促凋亡因子的釋放，抑制凋亡連鎖反應(yīng)。④Bcl-2通過與細(xì)胞凋亡蛋白(cell death abnormal，CED)9直接作用，可以抑制CED-3/CED-4復(fù)合體中CED-4的寡聚作用，從而阻止胱天蛋白酶2(caspase-2)活化，抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，從而起到抗凋亡作用[9-10]。

1.2Bax結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能人類的Bax基因位于染色體19q13.3～13.4，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，編碼的Bax蛋白由192個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為21 000，由9個α螺旋組成，具有BHI、BH2和BH3三個結(jié)構(gòu)域及C末端的跨膜結(jié)構(gòu)域，在C-末端α9螺旋可介導(dǎo)異源二聚體的形成，通過疏水槽與Bcl-2蛋白結(jié)合，α螺旋結(jié)構(gòu)是控制線粒體定位和二聚體形成的重要結(jié)構(gòu)[11]。Bax蛋白是構(gòu)成人B細(xì)胞和鼠淋巴干細(xì)胞的主要共沉淀蛋白，與 Bcl-2具有21%的同源性。Bax蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞膜、細(xì)胞核也有表達(dá)，是一種跨膜蛋白。

Bax促凋亡的途徑主要為以下兩種：①通過特殊的BH3結(jié)構(gòu)域識別線粒體膜上的Bcl-2蛋白，結(jié)合形成Bax-Bcl- 2異二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用；②細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的Bax蛋白可直接在線粒體膜上形成Bax-Bax同源二聚體，改變線粒體膜的滲透性，激活caspase反應(yīng)鏈，釋放細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)，啟動細(xì)胞凋亡過程，引發(fā)細(xì)胞凋亡連鎖反應(yīng)。綜上所述，Bax主要是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax的比例決定了細(xì)胞的命運(yùn)。

2青光眼視神經(jīng)損傷與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡

胚胎期視網(wǎng)膜是由神經(jīng)外胚葉發(fā)育而來，從外向內(nèi)分為10層。其中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層約含120萬個節(jié)細(xì)胞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞由較大的胞體及多極突觸組成，是視覺器官的三級神經(jīng)元，軸突進(jìn)入神經(jīng)纖維層，由視乳頭穿行出眼球，被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分割成神經(jīng)纖維束，在鞏膜水平通過10層連續(xù)片穿過篩板，神經(jīng)纖維通過篩孔與外側(cè)膝狀體核的神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，將視覺信息傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

青光眼的病理改變主要表現(xiàn)為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突的變性、萎縮、喪失[12]。其機(jī)制尚不完全明確，國外研究表明，高眼壓引起的軸漿運(yùn)輸阻斷，可引起阻斷處的膜性細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞內(nèi)容物在篩板處積聚，造成軸突腫脹[13-14]。同時細(xì)胞膜通透性增高，使Cl-、Na+、Ca2+、水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，水鈉潴留，神經(jīng)元細(xì)胞水腫壞死。細(xì)胞壞死破裂后，谷氨酸由細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞間隙，同時Mǘller細(xì)胞活化，導(dǎo)致腫瘤壞死因子α的釋放，引起谷氨酸攝取障礙，使過量的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，引起突觸后反應(yīng)，并通過Ca2+依賴的凋亡信號通路激活鈣敏感酶導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。破裂的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞釋放的谷氨酸可引起正常神經(jīng)節(jié)細(xì)胞繼發(fā)性凋亡[15]。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中線粒體是細(xì)胞凋亡的主要作用位點，其膜通透性的變化是凋亡早期標(biāo)志之一。細(xì)胞水腫使膜通透性增加，Ca2+內(nèi)流后線粒體膜電位降低，釋放大量促凋亡因子，包括caspase、細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子凋亡誘導(dǎo)因子等。細(xì)胞色素C啟動凋亡主要是通過與凋亡蛋白水解酶活化因子1結(jié)合，使凋亡蛋白水解酶活化因子1之間相互聚合，聚合物與caspase-9前體形成復(fù)合體(即凋亡小體)，進(jìn)而激活caspase效應(yīng)蛋白。caspase在正常細(xì)胞中以非活性的酶原形式存在，只有在特定條件下caspase才可被特定的蛋白水解，引起凋亡程序的啟動。

3Bcl-2/Bax在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

正常情況下Bcl-2和Bax兩種蛋白的表達(dá)量相對穩(wěn)定，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，而當(dāng)眼壓增高，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量明顯增多；Bc1-2高表達(dá)時，則Bax/Bax二聚體解離，生成更為穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異源二聚體，對抗其誘導(dǎo)凋亡的作用。Levkovitch-Verbin等[16]在不同的青光眼模型中檢測到Bax基因相對上調(diào)，Bcl-2蛋白中的Bax-xl顯著降低，因此，在高眼壓狀態(tài)下，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，與Bax/Bcl-2的比例關(guān)系密切。

3.1Bcl-2在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

3.1.1抑制細(xì)胞色素C釋放高眼壓引起的軸漿阻滯使細(xì)胞缺血、缺氧并大量自由基釋放，刺激細(xì)胞色素C從磷脂層釋放，細(xì)胞色素C必須穿過Bax蛋白孔隙釋放到細(xì)胞質(zhì)，刺激形成凋亡小體，激活下游的caspase-9，活化的caspase-9進(jìn)一步激活caspase-3，引起caspases級聯(lián)激活反應(yīng)。Bcl-2可通過與Bax結(jié)合，導(dǎo)致Bax構(gòu)象改變，阻止細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，研究證實，通過鈣調(diào)磷酸酶磷酸化促凋亡因子Bad，使其與Bcl-xl結(jié)合，降低Bcl-xl活性，可增加細(xì)胞色素C的釋放，啟動細(xì)胞凋亡[17-18]。

3.1.2下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平Huang等[19]和Sappington等[20]證實，眼壓升高將激活鈣蛋白酶，引起Ca2+水平升高，激活Ca2+依賴的凋亡信號通路，鈣調(diào)磷酸酶是線粒體依賴性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，眼壓升高激活鈣調(diào)磷酸酶，引起下游caspase-9的激活，導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)[18]，通過加入鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可以明顯抑制caspase-9的激活，從而降低神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2的特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可控制離子通道開放，降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平，同時Bcl-2高表達(dá)可使鈣調(diào)磷酸酶的活性降低，抑制Ca2+依賴的細(xì)胞凋亡。

3.1.3抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化青光眼模型中發(fā)現(xiàn)大量活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，它可通過產(chǎn)生一氧化氮合酶2合成一氧化氮，刺激細(xì)胞釋放促炎性因子(如腫瘤壞死因子α)，激活caspase蛋白，啟動凋亡程序[21]。Almeida等[22]認(rèn)為，Bcl-2可抑制miR-181的表達(dá)，從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生，Bcl-2對星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用也在多個實驗中被發(fā)現(xiàn)。

3.2Bax在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中作用

3.2.1維持電壓依賴性陰離子通道開放Bax可與電壓依賴性陰離子通道作用誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放[23]。研究表明[24]，Bcl-2家族抗凋亡蛋白的BH4結(jié)構(gòu)域?qū)﹄妷阂蕾囆躁庪x子通道的開放有抑制作用，而Bax和Bak的作用類似激活劑使電壓依賴性陰離子通道維持在一個開放的狀態(tài)，Bax可與電壓依賴性陰離子通道二聚體綁定而加大它的孔徑利于細(xì)胞色素C通過，激活caspase啟動凋亡機(jī)制，同時Bax可引起線粒體外膜的完整性丟失，細(xì)胞器裂變?nèi)芙狻?/p>

3.2.2促進(jìn)視神經(jīng)軸突損傷高眼壓模型中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高[19]、活性氧類增多，通過氧化應(yīng)激激活BH3-only蛋白，活化的BH3-only蛋白激活Bax，Bak引起凋亡[25]。Zalewska等[26]研究閉角型青光眼的視神經(jīng)軸突發(fā)現(xiàn)，凋亡Bak和Bax蛋白表達(dá)明顯高于抗凋亡Bcl-2和Bcl-xL蛋白，證明Bax在青光眼軸突損傷中發(fā)揮了積極作用。

3.3.3對抗Bcl-2抗凋亡蛋白位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體的促凋亡蛋白Bax，暴露出BH3螺旋，與Bcl-2蛋白中BH1和BH2兩個同源結(jié)構(gòu)域形成的疏水凹槽結(jié)合，通過靜電和疏水作用形成異源二聚體，二聚體的形成阻止了Bcl-2的生物活性[27]。同時，過多的Bax蛋白形成Bax/Bax同源二聚體，細(xì)胞對死亡信號的反應(yīng)性增強(qiáng)，啟動凋亡[28]。

4小結(jié)

青光眼致盲率極高，其高眼壓引起的內(nèi)環(huán)境改變，最終均可能通過Bcl-2家族途徑引導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前對青光眼視神經(jīng)保護(hù)的研究，主要是通過阻止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到延緩視神經(jīng)損壞的目的。通過研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡途徑，了解Bcl-2家族在凋亡過程中的作用機(jī)制及信號通路，可有選擇性地改變Bcl-2家族的表達(dá)，阻斷線粒體凋亡途徑，阻止青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。這將給無數(shù)青光眼患者帶來福音。

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Research Progress of Bcl-2,Bax in Glaucoma Retinal Ganion Cell ApoptosisWANGXue-wei，LIYan.(DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliateHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650031,China)

Abstract:Glaucoma is one of the three major blinding eye diseases to human,and apoptosis of retinal ganglion cells is known to play a key role in the process of optic nerve damage.However,the pathway of ganglion cell apoptosis and signaling avenue is not entirely clear.Bcl-2 family is one of the regulatory factors for apoptosis of retinal ganion cell involved in the process.The proportion of Bcl-2/Bax determines whether ganglion cells are dying.Here elaborates the mechanism of action and research progress of Bcl-2 family in glaucoma retinal ganion cell apoptosis.

Key words:Glaucoma; Bcl-2/Bax; Ganglion cells; Cell apoptosis

收稿日期：2014-12-22修回日期:2015-04-28編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.017

中圖分類號：R775.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4077-03