喬婷婷(綜述)，彭　芳(審校)

(大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000)

腫瘤多藥耐藥性體外模型的方法與評價

喬婷婷△(綜述)，彭芳※(審校)

(大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000)

摘要：建立優(yōu)勢腫瘤多藥耐藥性體外模型有助于闡明多藥耐藥的相關(guān)機制、優(yōu)化現(xiàn)有抗腫瘤藥物評價方法，并為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)研究以及開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供參考。該文介紹了腫瘤多藥性體外模型的建立方法，并對藥物大劑量間斷沖擊法、藥物濃度遞增法、大劑量間斷沖擊法結(jié)合濃度遞增法以及轉(zhuǎn)基因法結(jié)合藥物等建模方法進行綜合評價。

關(guān)鍵詞：腫瘤；多藥耐藥；模型；評價

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是當(dāng)今腫瘤治療的一大難題，據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，>90%的腫瘤患者死于不同程度的耐藥，腫瘤多藥耐藥性(multiple drug resistance，MDR)是腫瘤治療的主要障礙[1]。MDR是指在腫瘤治療中，腫瘤復(fù)發(fā)后對曾經(jīng)使用過的有效抗腫瘤藥物以及未曾用過的作用和機制尚不明確的其他抗腫瘤藥物無效[2]。目前對腫瘤耐藥機制的研究已經(jīng)取得了重要進展[3]。腫瘤細(xì)胞膜上P-糖蛋白轉(zhuǎn)運蛋白的高表達(dá)是MDR的主要作用機制之一，該蛋白是膜轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一員[4-6]。建立體外MDR模型是探討體外抗腫瘤方法的一種重要手段[7]?，F(xiàn)針對MDR模型的建立方法、特點及檢查指標(biāo)進行歸納整理，為進一步篩選有效逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的藥物、提高化療效果提供理論參考。

1腫瘤MDR體外模型的建立方法

在體外建立腫瘤耐藥細(xì)胞株至今已有20多年的歷史，目前，建立多藥耐藥細(xì)胞株的方法大體可分為：藥物大劑量間斷沖擊法、藥物濃度遞增法、大劑量間斷沖擊結(jié)合濃度遞增法、射線照射、基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因結(jié)合藥物篩選法等。其中，藥物大劑量間斷沖擊法和藥物濃度遞增法是體外誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株的常用方法[8-9]。

1.1藥物大劑量間斷沖擊法也稱為短時接觸培養(yǎng)法，其是給予細(xì)胞較高濃度的抗腫瘤藥物，作用短暫時間后換用不含藥物的培養(yǎng)基讓其繼續(xù)生長，換液處理漂浮起來的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量時重復(fù)上述方法繼續(xù)誘導(dǎo)，由此得到穩(wěn)定的、具有耐藥性的細(xì)胞株[10]。該方法在給藥時間上與臨床化療周期相似，省時方便、不易污染，但可能對細(xì)胞造成較大的傷害，且誘導(dǎo)時間長、步驟繁雜，細(xì)胞較易死亡[11]。由于其可以提高療效、減少化療藥物帶來的不良反應(yīng)，該方法常用于臨床。

誘導(dǎo)耐藥的藥物主要有阿霉素、5-氟尿嘧啶、雷替曲塞、順鉑以及紫杉醇等。延冰等[12]給予處于對數(shù)期的人胃癌細(xì)胞株BGC823大劑量順鉑，誘導(dǎo)形成人胃癌耐藥細(xì)胞株BGC823/順鉑。鄭婷婷等[13]采用大劑量阿霉素間歇誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7形成耐藥人乳腺癌細(xì)胞模型MCF-7/阿霉素。胡杰等[14]使用高濃度阿霉素對人肝癌細(xì)胞株7721進行間歇誘導(dǎo)，經(jīng)歷21個月后成功培養(yǎng)成7721/阿霉素人肝癌耐藥細(xì)胞模型。

1.2藥物濃度梯度遞增法又稱逐步誘導(dǎo)法、小劑量逐步增加劑量持續(xù)給藥法。該方法是將化療藥物從低濃度開始，逐漸增加藥物濃度，將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于該培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，直至產(chǎn)生耐藥性[15]。楊琰等[16]運用濃度梯度遞增法，采用紫杉醇進行誘導(dǎo)，歷時6個月，成功獲得卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞株SKOV3-ts。張福軍等[17]采用順鉑誘導(dǎo)口腔腺樣囊性癌Acc-3細(xì)胞成功建立耐藥細(xì)胞系A(chǔ)cc-3/順鉑。該方法較常用，建立的細(xì)胞系耐藥性穩(wěn)定、可靠，誘導(dǎo)所需時間短，建立的耐藥細(xì)胞株在凍存或撤藥后仍有較高的耐藥性，且耐藥倍數(shù)大于大劑量沖擊法，但其建立的耐藥模型的增殖能力較低[18]。

1.3大劑量間斷沖擊法結(jié)合濃度遞增法該方法是將以上兩種方法結(jié)合起來，其可以很好地模擬臨床上腫瘤出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象。徐小方和曹云新[19]采用濃度梯度遞增法聯(lián)合大劑量沖擊誘導(dǎo)人涎腺黏液表皮樣癌細(xì)胞株MEC，并成功得到了人涎腺黏液表皮樣癌多藥耐藥細(xì)胞系MEC/5-氟尿嘧啶。陸海等[20]使用此方法誘導(dǎo)建立人結(jié)腸癌奧沙利鉑多藥耐藥細(xì)胞系HCT116/L-OHP。這種方法建立的耐藥株耐藥倍數(shù)高于大劑量間歇沖擊法，其穩(wěn)定性好，但操作步驟復(fù)雜、培養(yǎng)時間較長，且劑量大小不易掌握[21]。

1.4化學(xué)誘變劑、射線照射化學(xué)誘變劑、射線輻射作為誘變劑，可提高基因變異概率，增加細(xì)胞誘導(dǎo)成功率，其有助于在短時間內(nèi)提高對耐藥細(xì)胞的篩選，可作為耐藥模型建立的輔助方式。李明耀[22]選取對X線相對敏感的鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2進行間歇性大劑量γ射線照射，在產(chǎn)生明顯輻射抗拒性的同時，也產(chǎn)生了MDR，獲得了鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株CNE-2R。此方法在卵巢癌、人腦膠質(zhì)瘤、人喉鱗癌等的治療中發(fā)揮著不可替代的作用。

1.5基因轉(zhuǎn)染該方法是將MDR1基因轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞株，從而獲得耐藥細(xì)胞株，此種耐藥表型的特點是耐藥基因型單純、轉(zhuǎn)染率不高，且在轉(zhuǎn)染過程中易因新基因的插入引起細(xì)胞性狀的改變[23]。

1.6基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因結(jié)合藥物篩選法該方法是近年來新興的一種建立多藥耐藥細(xì)胞株的方法，該方法建立模型所用時間短、耐藥性基因型單純、耐受性強、效率高且不易丟失，但技術(shù)復(fù)雜，要求的設(shè)備先進且不能用于多種復(fù)雜細(xì)胞株的建立，轉(zhuǎn)染率不高[24]。

2建立模型的檢測指標(biāo)與評價方法

評價耐藥模型的方法包括：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線測定、耐藥倍數(shù)檢測、耐藥標(biāo)志物檢測及耐藥機制檢測。

2.1倍增時間測定及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察陳婕和王家東[24]在建立喉癌耐藥細(xì)胞株Hep2/5-氟尿嘧啶的過程中對耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性進行觀察，觀察耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率進行檢測，以此判定耐藥細(xì)胞是否具有耐藥性。

2.2生長曲線測定王金華等[25]建立人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株OV1228/Taxol后，繪制細(xì)胞生長增殖曲線，根據(jù)Patterson公式，計算細(xì)胞在對數(shù)生長期的倍增時間。

2.3耐藥倍數(shù)的檢測用一種化療藥物誘導(dǎo)建立的多藥耐藥細(xì)胞系一般需要用同種、同類或不同種類的多種化療藥物檢測細(xì)胞的敏感性以判定其MDR，耐藥性一般用耐藥倍數(shù)表示，實驗常采用四甲基偶氮唑藍(lán)法、磺酰羅丹明比色法檢測。四甲基偶氮唑藍(lán)法可用于檢測加入不同藥物后耐藥細(xì)胞的敏感性和半抑制濃度、交叉耐藥、計算耐藥指數(shù)等[26]。檢測細(xì)胞內(nèi)熒光染料羅丹明123的積累變化，可用來對藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的活性進行評價[27]。光學(xué)顯微鏡、透射電鏡對細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化的觀察，臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞技術(shù)繪制生長曲線計算細(xì)胞倍增時間，Patterson法對細(xì)胞群體倍增時間計算，Hambur-Salmon法對集落生成率計算[28]，胰酶-姬姆薩G顯帶法進行染色體分析，染色體數(shù)平板克隆形成率，以上幾種方法均可用于細(xì)胞耐藥倍數(shù)的檢測。

2.4耐藥標(biāo)志物的檢測耐藥標(biāo)志物包括多藥耐藥蛋白及其他標(biāo)志性惡性功能分子[29]。常見的耐藥標(biāo)志物有腫瘤多藥耐藥基因1產(chǎn)生的P糖蛋白[30]、MDR相關(guān)蛋白基因、腺苷三磷酸結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(該蛋白與P糖蛋白都屬于膜轉(zhuǎn)運蛋白家族)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2、Bax蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、乳腺癌耐藥蛋白以及肺耐藥相關(guān)蛋白等。王金華等[25]在人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株 OV1228/Taxol的建立中發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C-a可能與腫瘤多藥耐藥基因1的表達(dá)相關(guān)。常用的檢測耐藥標(biāo)志物的方法有實時熒光定量聚合酶連反應(yīng)檢測MDR基因信使RNA的表達(dá)，蛋白印跡法檢測P糖蛋白的表達(dá)，基因芯片法檢測信號通路的改變。

2.5耐藥機制的檢測MDR已成為腫瘤治療的最大阻礙。腫瘤多藥耐藥機制包括以下幾種：①耐藥相關(guān)蛋白高表達(dá)，包括P糖蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白、乳腺癌耐藥蛋白以及多藥耐藥蛋白；②影響藥物代謝；③影響藥物作用的靶點；④細(xì)胞凋亡受抑。其中P糖蛋白與多藥耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)，該蛋白具有外排泵功能，其能使細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，使細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積減少，最終導(dǎo)致抗癌效應(yīng)喪失，這是耐藥細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡受抑在腫瘤細(xì)胞耐藥中有重要作用，其中存活蛋白是主要的凋亡抑制分子，主要表達(dá)于人未分化的成熟組織以及多種腫瘤細(xì)胞中[30]。腫瘤MDR的產(chǎn)生可能與DNA修復(fù)、蛋白激酶C、微管蛋白相關(guān)蛋白、體內(nèi)激素、腫瘤血管形成以及線粒體凋亡方式等多種因素有關(guān)[31-32]。

3小結(jié)

在體外建立穩(wěn)定的腫瘤多藥耐藥模型，對研究MDR的機制及逆轉(zhuǎn)具有重要意義。一直以來，多位學(xué)者已成功建立了一系列的多藥耐藥體外模型，這些模型為進一步研究腫瘤耐藥、提高化療效果等奠定了基礎(chǔ)。尋找能有效逆轉(zhuǎn)MDR的逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前腫瘤化療亟待解決的難題，從天然資源中尋求高效、低毒、作用靶點廣泛的耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為MDR研究的必然趨勢和熱點，相信在不久的將來研究者能夠克服這些難題，使腫瘤得到很好的治療。

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Methods and Evaluation of in vitro Multi-drug Resistance Tumor ModelQIAOTing-ting，PENGFang.(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity，Dali671000,China)

Abstract:Setting up advantageous multi-drug resistant tumor model in vitro can provide guidance for clarify the multi-resistance related mechanism,and optimize the existing antitumor drug evaluation methods,provide references for reversion of multi-drug resistant tumor and the development of new antitumor drugs.Here introduces the modeling methods of multi-drug resistant tumor in vitro,analyzing and summarizing the intermittent shock method for large dose drug,the method of increasing drug concentration,large doses of discontinuous shock combined with concentration increasing method and genetically modification combined with drug screening method.

Key words:Tumor； Multi-drug resistant； Model； Evaluation

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-03-15編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.023

中圖分類號：R752.11

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4093-03