龍立梅，宋沙沙，李 柰，樊 琛，李小波，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

3 種名優(yōu)綠茶特征香氣成分的比較及種類判別分析

龍立梅，宋沙沙，李 柰，樊 琛，李小波，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立綠茶香氣分析方法，研究固相微萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)綠茶香氣物質(zhì)種 類和總量的影響，并對(duì)西湖龍井、黃山毛峰和信陽毛尖3 種名優(yōu)綠茶特征香氣成分進(jìn)行分析研究和種類判別。結(jié)果表明：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在80 ℃條件下吸附60 min，能達(dá)到最佳吸附效果；通過對(duì)3 種綠茶特征香氣組分分析，分析鑒定出58 種綠茶特征香氣成分，相對(duì)含量較高的主要成 分依次為：香葉醇、（Z）-己酸-3-己烯酯、芳樟醇、壬醛、反-橙花叔醇等。利用16 個(gè)共有特征香氣成分峰的相對(duì)峰面積，建立多元化典型判別函數(shù)，采用逐步判別分析技術(shù)對(duì)31 個(gè)綠茶樣品進(jìn)行了很好的種類判別，判別正確率近96.8%。

頂空固相微萃??；氣相色譜-質(zhì)譜法；綠茶；香氣成分；種類判別

茶葉香氣是茶葉的重要品質(zhì)之一，茶葉中的芳香物質(zhì)亦稱“揮發(fā)性香氣組分”，是由性質(zhì)不同、含量差異懸殊的多種物質(zhì)組成的混合物，在茶葉中的絕對(duì)含量很少，一般只占干物質(zhì)質(zhì)量的0.01%～0.05%，卻是決定茶葉品質(zhì)的重要因子之一[1]。在感官評(píng)審中，香氣對(duì)茶葉感官品質(zhì)的貢獻(xiàn)率達(dá)25%～35%[2]，因此對(duì)茶葉香氣成分的研究意義重大。

研究表明，在茶葉中已經(jīng)分離鑒定300多種香氣成分，而且隨著研究工作的深入，新的成分不斷被發(fā)現(xiàn)和鑒定[3]。由于受產(chǎn)地、環(huán)境、生長周期、生產(chǎn)工藝等因素的影響，不同品種的茶葉香氣組成也有較大差別[4-7]，對(duì)茶葉的品質(zhì)評(píng)定影響也較大，因此能夠快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)不同品種綠茶之間香氣成分的差異對(duì)地理標(biāo)志產(chǎn)品的保護(hù)，名優(yōu)綠茶的真?zhèn)舞b別具有重要意義。本研究利用具有高選擇性、高富集能力、分析快速等特點(diǎn)的頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）技術(shù)分別提取西湖龍井、黃山毛峰和信陽毛尖3 種名優(yōu)綠茶香氣成分，通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀分析比較了3 種綠茶的香氣特征成分，并利用逐步判別分析技術(shù)對(duì)不同綠茶種類進(jìn)行了判別分析，為名優(yōu)綠茶的品質(zhì)評(píng)定和種類判別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茶樣為2013年4～5月的春茶，分別為黃山毛峰2 種工藝3～4 個(gè)等級(jí)7 個(gè)樣品 安徽謝裕大茶葉股份有限公司；西湖龍井御牌、貢牌和獅牌3 個(gè)品牌4 個(gè)等級(jí)12 個(gè)樣品 杭州西湖區(qū)茶葉有限公司；信陽毛尖3 批4 個(gè)等級(jí)12 個(gè)樣品 信陽市文新茶葉有限責(zé)任公司。樣品用復(fù)合鋁箔袋密封，保存于4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2 儀器與設(shè)備

QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U萃取頭 美國Supelco公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME條件的優(yōu)化

影響SPME萃取效果的技術(shù)參數(shù)有萃取頭的種類、樣品用量、萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取瓶容積等，其中重點(diǎn)優(yōu)化設(shè)計(jì)溫度和時(shí)間2 項(xiàng)，采用單因素對(duì)比試驗(yàn)；萃取頭選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U萃取頭[8-10]，樣品用量和萃取瓶容積分別設(shè)定為3.0 g和200 mL。

在感官審評(píng)茶葉中，通常用100 ℃的沸水沖泡茶葉5 min后開蓋嗅香氣，此時(shí)的溫度為75 ℃；而審評(píng)茶葉香氣最適合的葉底溫度為55 ℃[11]。為保證萃取出的茶葉揮發(fā)性物質(zhì)成分與感官審評(píng)時(shí)的一致性，并確定出最佳萃取溫度，故將SPME萃取溫度控制在40～90 ℃之間，設(shè)計(jì)6 個(gè)水平，間隔10 ℃；萃取時(shí)間對(duì)比試驗(yàn)：設(shè)計(jì)20～70 min 6 個(gè)水平，間隔10 min，分別進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.2 SPME操作

準(zhǔn)確稱取茶葉樣品3.0 g，放入200 mL的三角瓶?jī)?nèi)，加入沸水150 mL，用錫箔紙封口，室溫條件下靜置5 min，待茶葉香氣充分揮發(fā)和平衡。首先將其置于80 ℃恒溫水浴鍋中，將已經(jīng)老化5 min的固相微萃頭穿透錫箔紙插入三角瓶?jī)?nèi)茶湯上方，固定好SPME的手柄，小心推出纖維頭并開始計(jì)時(shí)，吸附60 min 后取出，隨即插入GC-MS儀器的進(jìn)樣口，在250 ℃條件下熱脫附5 min。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：Rxi-5MS（30 m×0.25 mm，0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱，升溫程序：初始40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升到80 ℃，保持2 min，再以2 ℃/min升到160 ℃，不保持，最后以12 ℃/min升到250 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純He氣（純度99.999%）；柱流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離源；離子化電壓70 eV；離子源溫度200 ℃；質(zhì)譜掃描范圍35～450 u；檢測(cè)器電壓1.00 kV。

1.3.4 香氣成分的定性定量分析

通過對(duì)總離子色譜圖峰積分，積分參數(shù)為斜率5 000/min，半峰寬2 s，變參時(shí)間1 000 min；經(jīng)計(jì)算機(jī)與質(zhì)譜庫匹配，質(zhì)譜庫版本為NIST 05s.LIB和NIST 05.LIB，挑選出匹配度不小于80的峰號(hào)；根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量、分子式以及分子結(jié)構(gòu)確定各個(gè)出峰物質(zhì)的名稱。各色譜峰的峰面積與總峰面積之比為各香氣組分的相對(duì)含量[12-14]。

1.3.5 不同種類綠茶的判別分析

將所得到的每個(gè)樣品色譜圖以最大之主峰為參照，計(jì)算相對(duì)峰面積，以31 個(gè)樣品的16 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件，使用步進(jìn)式方法中的Wilks λ法進(jìn)行逐步判別分析，建立判別方程，并對(duì)所建立的判別方程進(jìn)行交叉驗(yàn)證分析，驗(yàn)證判別方程對(duì)初識(shí)分組的分類結(jié)果[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度的確定

萃取溫度是影響分析速度的一個(gè)重要因素。溫度升高，分析物擴(kuò)散速度增大，同時(shí)加強(qiáng)了對(duì)流過程，因此升溫有利于提高分析速度。同時(shí)，溫度升高，使分析物的分配系數(shù)減小，從而使固相吸附量減少。所以在使用SPME技術(shù)時(shí)應(yīng)尋找最佳的萃取溫度。

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，兼有極性和非極性涂層，吸附范圍較廣，因此吸附的茶葉香氣物質(zhì)種類多，這與文獻(xiàn)[11,16-17]的結(jié)果一致。分別在40、50、60、70、80、90 ℃溫度條件下進(jìn)行茶樣香氣物質(zhì)的萃取，經(jīng)GC-MS分析獲得不同處理樣品的香氣總峰面積和峰容量，結(jié)果見圖1。隨著萃取溫度的升高，總峰面積及總峰數(shù)均隨之升高，說明萃取頭吸附量明顯變大，不同吸附溫度對(duì)香氣總峰面積的影響呈現(xiàn)單峰曲線，當(dāng)溫度小于80 ℃時(shí)，總峰面積隨溫度的升高而增大，在80 ℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后隨溫度的升高而略有減小。綜合以上結(jié)果，適宜的吸附溫度為80 ℃。

圖 1 萃取溫度對(duì)總峰面積（A）和峰數(shù)（B）的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the total peak area and total peak number

2.1.2 萃取時(shí)間的確定

萃取時(shí)間即萃取達(dá)到平衡所需要的時(shí)間，由待分析物的分配系數(shù)、物質(zhì)的擴(kuò)散速率、樣品基質(zhì)、樣品體積、不同萃取頭膜厚和吸附能力以及涂層的物理化學(xué)性質(zhì)等因素決定，是影響固相吸附量的一個(gè)重要因素。在未達(dá)到吸附平衡前，固相吸附量隨時(shí)間變化而增加。萃取時(shí)間應(yīng)達(dá)到吸附平衡時(shí)間后方可進(jìn)行分析[18]。

圖 2 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積（A）和峰數(shù)（B）的影響Fig.2 Effect of extraction time on the total peak area and total peak number

在80 ℃條件下用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，分別在 20、30、40、50、60、70 min條件下進(jìn)行茶樣香氣物質(zhì)的萃取，經(jīng)GC-MS分析獲得不同處理樣品的香氣總峰面積和峰容量，結(jié)果見圖2。在60 min前，隨著吸附時(shí)間的延長，香氣的吸附量逐漸增加，60 min后吸附量變化不大，并且在60 min有最大吸附量，因此，選擇最佳吸附時(shí)間為60 min。

2.2 3 種名優(yōu)綠茶特征香氣成分的分析與比較

2.2.1 3 種綠茶特征香氣成分的分析

應(yīng)用優(yōu)化的SPME條件捕集茶樣香氣物質(zhì)，熱脫附后進(jìn)行GC-MS分析，分別獲得西湖龍井、黃山毛峰和信陽毛尖的總離子流圖（圖3）。

圖 3 西湖龍井茶（A）、黃山毛峰茶（B）、信陽毛尖茶（C）香氣成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms of aroma compounds of Xihu Longjing tea, Huangshan Maofeng tea and Xinyang Maojian tea

對(duì)茶樣香氣總離子流圖進(jìn)行分析，在西湖龍井茶樣中最多檢出92 種揮發(fā)性成分，其中共有峰46個(gè)，占總峰面積的86.91%；在黃山毛峰茶樣中最多檢出54 種揮發(fā)性成分，其中共有峰34 個(gè)，占總峰面積的84.81%；在信陽毛尖茶樣中最多檢出45 種揮發(fā)性成分，其中共有峰25 個(gè)，占總峰面積的77.99%。通過面積歸一化法求得每種化合物的相對(duì)含量，如表1所示。3 種綠茶篩選并鑒定出特征峰總數(shù)為58 個(gè)，其中3 種綠茶的共有特征峰16 個(gè)，分別占總峰面積的57.18%、67.78%、71.51%。主要包括的化合物有芳樟醇、壬醛、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、3-己烯基酯、香葉醇、α-蓽澄茄油烯、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、δ-蓽橙茄烯、反-橙花叔醇、（+）-α-長葉蒎烯、香榧醇、鄰苯二甲酸二異丁酯，這些成分對(duì)構(gòu)成綠茶的特征風(fēng)味成分具有重要作用[19]。

各成分在不同茶樣中的含量不同，說明不同品種、不同產(chǎn)地、不同加工方法的綠茶有一定的差異。西湖龍井中含量較高的化合物依次為：（Z）-己酸-3-己烯酯（12.45%）、β-紫羅蘭酮（6.97%）、香葉醇（6.82%）、柏木腦（5.16%）、壬醛（4.77%）、癸醛（4.53%）6 種物質(zhì)占總峰面積的40.70%；黃山毛峰含量較高的化合物依次為：香葉醇（15.89%）、反-橙花叔醇（9.28%）、芳樟醇（8.25%）、壬醛（8.11%）、（Z）-己酸-3-己烯酯（6.31%）、茉莉酮（5.91%）6 種物質(zhì)占總峰面積的53.34%；信陽毛尖含量較高的化合物依次為：香葉醇（17.69%）、壬醛（11.91%）、芳樟醇（6.20%）、δ-蓽橙茄烯（5.63%）、癸醛（5.28%）、反-橙花叔醇（4.99%）6種物質(zhì)占總峰面積的51.70%。

表 1 3 種綠茶的特征香氣成分及相對(duì)含量Table 1 Characteristic aroma components and their relative contents in three kinds of green tea

續(xù)表1

2.2.2 3 種綠茶特征香氣成分種類的比較

表1中列出的化合物可以分為醇類、醛類、酮類、酯類、萜烯類、烷烴類和其他化合物共7 類主要化合物，每類化合物的比較結(jié)果如圖4所示。西湖龍井中含有的醇類和酯類化合物最多，而黃山毛峰和信陽毛尖含有的醇類化合物最多。其中，醇類化合物相對(duì)含量均在23%～40%之間，香葉醇、芳樟醇、反-橙花叔醇和香榧醇是3 種綠茶中共有的醇類化合物。香葉醇具有溫和、甜的玫瑰花氣息，是主要的呈香物質(zhì)之一，在黃山毛峰和信陽毛尖2 種綠茶中的相對(duì)含量最高，分別為15.890%和17.685%，在西湖龍井中的含量?jī)H有6.82%；壬醛、癸醛和β-環(huán)檸檬醛在3 種綠茶中都被檢出，西湖龍井含醛類化合物10 種、黃山毛峰4 種、信陽毛尖5 種；含量較高的酮類化合物是帶有紫羅蘭香氣的β-紫羅蘭酮、茉莉花香的茉莉酮以及果香、清香的香葉基丙酮；酯類化合物中的共有成分包括（Z）-己酸-3-己烯酯、3-己烯基酯和鄰苯二甲酸二丁酯。（Z）-己酸-3-己烯酯是常見綠茶高沸點(diǎn)組分，具有強(qiáng)烈彌散性梨香[20]，在西湖龍井中的相對(duì)含量最高，可達(dá)12.449%，而黃山毛峰5.907%，信陽毛尖中4.85%；在3種綠茶中都存在萜烯類化合物還有δ-蓽橙茄烯、（+）-α-長葉蒎烯和α-蓽澄茄油烯，這些化合物對(duì)綠茶的香氣形成均有貢獻(xiàn)。此外，柏木腦、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、反-2,4-庚二烯醛、（4E）-4-己烯己酸酯等僅在西湖龍井中被檢出，己酸環(huán)己酯、（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸甲酯、十八醇等僅在黃山毛峰中被檢出，1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）-（1,2,3,4,4a,7）六氫萘僅在信陽毛尖中被檢出，相對(duì)含量較少的物質(zhì)未必對(duì)香氣的貢獻(xiàn)較少，任何一種綠茶的香氣都是其所含的不同芳香物質(zhì)以不同濃度組合的綜合表現(xiàn)[21-24]。

圖 4 3 種綠茶特征香氣成分種類的比較Fig.4 Comparisons of the chemical classes of characteristic aroma components in three kinds of green tea

2.3 基于香氣特征成分的綠茶種類判別分析

判別分析是根據(jù)多種因素（指標(biāo)）對(duì)事物的影響，從而對(duì)事物進(jìn)行判別分類的統(tǒng)計(jì)方法，在許多經(jīng)濟(jì)作物的品質(zhì)與類別鑒定研究中取得了較好的效果[25]。因此，用該方法根據(jù)不同綠茶香氣特征成分進(jìn)行種類判別分析具有重要意義。

以16 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積作為原始數(shù)據(jù)，分別設(shè)為變量X1X2……X16，根據(jù)SPSS 20.0計(jì)算的非標(biāo)準(zhǔn)化判別函數(shù)系數(shù)，得到的判別方程組為：

式中：X1、X3、X8、X14分別代表不同保留時(shí)間色譜峰的相對(duì)峰面積。

判別函數(shù)F1、F2的特征值分別為19.400和2.315，第1個(gè)函數(shù)解釋了所有變異的89.3%，第2個(gè)函數(shù)解釋了余下的10.7%，典型相關(guān)系數(shù)分別為0.975和0.836，Wilks‵Lambda數(shù)據(jù)對(duì)判別函數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2個(gè)判別函數(shù)（P＜0.05）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從分類結(jié)果圖5可知，在31 個(gè)茶樣中，除一種黃山毛峰茶與信陽毛尖區(qū)分度不大以外，該方法對(duì)初始分組樣品中的96.8%個(gè)進(jìn)行了正確分類，對(duì)交叉驗(yàn)證分組樣品中的96.8%個(gè)進(jìn)行了正確分類。各樣品判別函數(shù)得分值作圖（圖5），判別分類效果較好。同一品種不同等級(jí)的茶葉能實(shí)現(xiàn)很好的歸類，黃山毛峰2種不同加工工藝較等級(jí)的差異對(duì)茶葉的香氣的影響稍大，但是與 其他2 種茶葉的區(qū)分仍然很顯著，表明采用香氣特征成分可以對(duì)綠茶的種類進(jìn)行很好的分類判別。

圖 5 3 種綠茶香氣特征成分的判別分析Fig.5 Discriminant classifi cation of characteristic aroma components of three kinds of green tea

3 結(jié) 論

3 種名優(yōu)綠茶由于其品種、產(chǎn)地、加工工藝的不同，表現(xiàn)出不同的香氣特征。HS-SPME-GC-MS技術(shù)可以對(duì)其特征香氣成分進(jìn)行很好的鑒別和分析。總體而言，西湖龍井、黃山毛峰和信陽毛尖3 種綠茶的香氣成分主要為醇類、酯類、醛類和酮類，但是各類成分的種類及其相對(duì)含量有一定區(qū)別。根據(jù)其共有特征香氣成分含量差異通過統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算可以很好實(shí)現(xiàn)不同茶葉種類的判別，這對(duì)于地理標(biāo)志產(chǎn)品的保護(hù)、名優(yōu)綠茶的真?zhèn)舞b別等有重要的意義。

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Comparisons of Characteristic Aroma Components and Cultivar Discriminant Analysis of Three Varieties of Famous Green Tea

LONG Limei, SONG Shasha, LI Nai, FAN Chen, LI Xiaobo, CAO Xueli*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

This study aimed to determine the aroma components of green tea by headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME) coupled to gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The effects of SPME temperature and adsorption time on the kinds and amounts of aroma compounds in green tea were evaluated. The characteristic aroma components in three kinds of green teas, Xihu Longjing, Huangshan Maofeng and Xinyang Maojian, were identifi ed. The results showed that optimum adsorption was achieved using 50/30 μm DVB/CAR/PDMS fi ber for adsorption at 80 ℃ for 60 min. A total of 58 characteristic aroma compounds were found in the three kinds of green tea, with geraniol, 3-hexenyl ester, (Z)-hexanoic acid, lina lool, 1-nonanal and nerolidol being the major aroma compounds in decreasing order of abundance. Canonical discriminant functions were established using the relative peak areas of 16 aroma compounds common to these three kinds of tea, which could effectively discriminate among 31 green tea samples with an accuracy of nearly 96.8%.

headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); green tea; aroma components; variety discriminant

TS272.5

A

1002-6630（2015）02-0114-06

10.7506/spkx1002-6630-201502022

2014-06-28

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310230）；北京工商大學(xué)研究生科研學(xué)術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目

龍立梅（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：longlimei112@sohu.com

*通信作者：曹學(xué)麗（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x和分析。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn