韓啟厚 ，古瑜 ，于海龍 ，李玉珍 ，刑堃

（1.天津科潤蔬菜研究所，300380；2.內(nèi)蒙古通遼市開魯縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心；3.天津市北辰區(qū)種植業(yè)中心）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）又稱四季豆、蕓豆、扁豆等，分為食豆和食莢兩種類型，菜豆在我國各省市均有栽培，種植范圍十分廣泛，是我國重要的糧食作物和蔬菜作物。菜豆能為人類提供豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及礦物質(zhì)等[1]，其嫩莢尤其是人們喜食的蔬菜之一。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在許多作物上得到應(yīng)用，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到巨大的推動作用，但關(guān)于菜豆組織培養(yǎng)技術(shù)的報道卻相對較少[2]，主要是由于菜豆組織的再生能力較弱，組織培養(yǎng)難度較大。因此，本試驗對菜豆組培快繁技術(shù)做了初步研究，為菜豆種質(zhì)資源保存、種質(zhì)資源創(chuàng)新、脫毒技術(shù)應(yīng)用、遺傳轉(zhuǎn)化以及優(yōu)良品種快繁等工作提供可以利用的技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及時間、地點

供試材料為雙豐3號（天津科潤蔬菜研究所提供），試驗于2012年1月至2014年6月在天津科潤蔬菜研究所組培實驗室完成。

1.2 種子消毒

挑選籽粒均勻一致的菜豆種子，放置于玻璃容器內(nèi)。采用如下4種常見豆類種子消毒方法，并作適當改動。T1：70%乙醇處理3 min，無菌水沖洗3次，25%次氯酸鈉溶液浸泡20 min，無菌水洗滌5～6次[3]；T2：25%次氯酸鈉處理 20 min，無菌水洗滌 5～6次[4]；T3：氯氣熏蒸 6 h[5]；T4：氯氣熏蒸 12 h[6]。

將處理種子的種臍向下接種于萌發(fā)培養(yǎng)基（MS[7]+6-BA 0.5 mg/L）中，密封好后放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每個處理50粒種子，3次重復(fù)，共600粒種子。培養(yǎng)室環(huán)境溫度為25℃，光照強度為4 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。培養(yǎng)5～6 d即可長出幼苗，供試驗備用。

1.3 增殖培養(yǎng)

在超凈工作臺上，取生長5～6 d的2葉1心的無菌苗，放置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，切掉胚根及2片真葉，保留葉柄，作為外植體備用。將處理好的外植體的下胚軸部分插入增殖培養(yǎng)基中，插入深度0.5 cm左右。增殖培養(yǎng)基為MSB5（將MS培養(yǎng)基中的有機成分換成B5培養(yǎng)基的有機成分，其他成分不變，縮寫為MSB5）加入不同濃度的6-BA，最終培養(yǎng)基中 6-BA 濃度分別為 0.5、1.0、3.0、5.0 mg/L，每個培養(yǎng)瓶中3個外植體，每個處理10瓶，3次重復(fù)，共120瓶。將密封好的培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。

培養(yǎng)7 d后，再生芽長到2～3 cm切一次，記錄再生芽數(shù)量；將外植體置于相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，14 d后切第二次，記錄再生芽數(shù)量，最后統(tǒng)計兩次再生芽數(shù)量，篩選最佳快繁培養(yǎng)基。

1.4 再生芽的生根

切取通過快繁獲得的均勻一致的再生植株，插入含有不同濃度IBA的培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為1/2 MSB5，IBA 濃度分別為 0、0.1，0.3、0.5、0.7、1.0 mg/L，每個培養(yǎng)瓶接種再生芽10個，每個處理5瓶，3次重復(fù)，共90瓶。10 d后測生根率和生根數(shù)量，生根率和生根數(shù)量最多的培養(yǎng)基為最佳生根培養(yǎng)基。

1.5 組培苗的移栽

先將生根后的組培苗開蓋煉苗3～4 d，后將組培苗連瓶一起放置溫室內(nèi)煉苗3～4 d，煉苗結(jié)束后將組培苗取出，在水中除掉根部的培養(yǎng)基，盡量使再生根完整。將完整的組培苗移栽到含有不同比例基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，基質(zhì)處理分為6種，分別為100%草炭、蛭石、蘑菇渣、草炭+蛭石（1∶1）、草炭+蘑菇渣（1∶1）、蘑菇渣+蛭石（1∶1），每個處理移栽 30 株組培苗，移栽完的營養(yǎng)缽放置在有塑料薄膜覆蓋的小拱棚內(nèi)，移栽后前3 d適當向拱棚內(nèi)噴水，保證拱棚內(nèi)相對濕度達100%，3 d后逐漸放風直至除掉拱棚，10 d后調(diào)查成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子消毒方法的篩選

由表1可知，將4種消毒方法處理后的種子均無污染，可見4種方法均有較好的消毒效果，但對種子出芽率影響有很大差別。T2處理對發(fā)芽率影響最小，該處理下種子發(fā)芽率極顯著高于其他3個處理，T4處理對種子芽率影響最大，發(fā)芽率僅4%，極顯著低于其他3個處理。T3、T4均為氯氣熏蒸消毒，氯氣熏蒸是最近大豆種子消毒采用的方法，用其消毒對菜豆種子傷害較大。本試驗結(jié)果表明，氯氣不適用于菜豆種子消毒，而采用次氯酸鈉消毒最佳。

表1 接種后7 d種子污染及發(fā)芽情況

表2 接種后切兩次（7 d和14 d）植株擴繁情況

2.2 增殖培養(yǎng)基的篩選

從表2可看出，在本試驗范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，再生芽數(shù)量不斷增加。MSB5+6-BA 5.0 mg/L培養(yǎng)基中再生芽數(shù)量在第一次和第二次均最高，顯著高于其他培養(yǎng)基，并與MSB5+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基達極顯著差異水平。第二次再生芽數(shù)量均要比第一次略低，但增長趨勢與第一次完全一致。兩次再生芽數(shù)量總和，MSB5+6-BA 5.0 mg/L培養(yǎng)基顯著高于其他培養(yǎng)基，并與MSB5+6-BA 0.5 mg/L和MSB5+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基達極顯著差異水平。從3組數(shù)據(jù)上看，MSB5+6-BA 5.0 mg/L培養(yǎng)基是最佳的快繁培養(yǎng)基，擴繁系數(shù)為9.2個/外植體。

2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

從表3可看出，當IBA濃度為0.1 mg/L時生根率最高，達到92.5%，顯著高于不加IBA的培養(yǎng)基，其后，隨著IBA濃度增加，生根率逐漸下降。從生根數(shù)量上看，同樣是IBA濃度為0.1 mg/L時最多，達12.3根/株。隨著IBA濃度的增加，促進了再生植株基部愈傷組織的產(chǎn)生，抑制了再生植株的生根。綜上，最佳生根培養(yǎng)基是1/2 MSB5+IBA 0.1 mg/L。

2.4 移栽基質(zhì)的篩選

從表4可以看出，無論是單一基質(zhì)還是不同基質(zhì)混配，移栽成活率均在90%左右，其中以草炭∶蘑菇渣比例為1∶1的時候成活率最高，達到了97%，可能是由于草炭和蘑菇渣的透氣性較好，并且其中都含有一定的營養(yǎng)物質(zhì)和配料，能夠充分供應(yīng)組培苗的生長，而其他基質(zhì)養(yǎng)分不夠充足或養(yǎng)分比較單一，因而導(dǎo)致移栽成活率較低，因此，草炭∶蘑菇渣=1∶1為最佳的移栽培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

種子消毒方法多種多樣，本試驗比較了國外菜豆及大豆種子常用的4種消毒方法。根據(jù)本試驗和前人的研究結(jié)果，作者認為，氯氣穿透力較強，且操作時濃度不易精確把握，對種子刺激作用比其他方法強烈，因此氯氣熏蒸比較適合于大豆[5]等一些種皮相對較厚或?qū)β葰獠惶舾械姆N子消毒，對種子損傷小，而用在菜豆種子上則嚴重影響種子的發(fā)芽率，不適于菜豆種子消毒。次氯酸鈉消毒是菜豆種子消毒最好的選擇。菜豆種子由于產(chǎn)地及采收習慣存在差異，種皮表面污染物多少也同樣存在差異，如果種子帶菌量較多，可適當在次氯酸鈉消毒方法上增加一些消毒步驟，消毒會更加徹底；而對于一般比較干凈的菜豆種子來講，采用次氯酸鈉消毒足以達到徹底消毒的效果。

快繁是在最短的時間內(nèi)獲得最多的再生植株，本試驗主要是利用菜豆幼苗上存在多個芽點的特點，采用6-BA刺激芽點生長產(chǎn)生叢生不定芽，達到快繁的目的，比通過愈傷組織培養(yǎng)更容易獲得再生植株[8]，增殖效率更高。隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的提高，再生芽數(shù)量逐漸增加，而且相同6-BA濃度第二次再生芽數(shù)量少于第一次，說明在繼代培養(yǎng)過程中器官形成能力和增殖能力有隨著培養(yǎng)代數(shù)增加而下降的趨勢，這與Crocomo等[9]結(jié)論相同。

再生植株生根是比較容易的，即使不加入任何激素其依然可生根，但一般生根少、質(zhì)量差。加入一定濃度的生長素可以促進根的生成，但生長素濃度過大會抑制生根[10]，刺激再生植株基部生成大量愈傷組織，從而阻礙了再生根的形成[11]。

表3 IBA濃度對再生植株生根的影響

表4 不同基質(zhì)組合對再生植株成苗率的影響

組培苗移栽成活與否主要是看組培苗是否能夠適應(yīng)環(huán)境的變化，采用草炭和蘑菇渣混合基質(zhì)效果最好，主要是草炭和蘑菇渣的透氣性好，而且其中養(yǎng)分及有機質(zhì)成分也相對較高，滿足了組培苗對氧氣及養(yǎng)分的需求，因此最有利于組培苗成活。

菜豆組培快繁與常規(guī)種子繁種相比，不受時間及空間的限制，并且快繁系數(shù)遠遠高于種子繁殖。菜豆組培快繁的成功將為優(yōu)良種質(zhì)資源保存、保持種性及快速推廣提供十分有效的手段。

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