趙慧君，余海忠，王海燕，朱文權(quán)

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蘋果赤霉素3-氧化酶1()在煙草中的表達(dá)研究

趙慧君，余海忠，王海燕，朱文權(quán)

(湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441053)

近年來(lái)在擬南芥、水稻等物種中對(duì)赤霉素生物合成途徑的研究日益完善，但蘋果中的赤霉素生物合成途徑尚未明確. 文章通過構(gòu)建蘋果GA-3氧化酶基因的植物表達(dá)載體，并將該基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到煙草中來(lái)快速驗(yàn)證其在植物中的功能. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)煙草的表型產(chǎn)生了很大的影響，既有赤霉素過量的典型表型，也有非典型的表型. 造成這種表型的原因可能有兩個(gè)：一是在煙草赤霉素生物合成途徑中，不是最關(guān)鍵的基因；二是基因的表達(dá)需要特定的的轉(zhuǎn)錄因子，在煙草中的啟動(dòng)子和蘋果中不同，結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子也不同，從而造成了表型的多樣化.

赤霉素；蘋果；；煙草

赤霉素是一種非常重要的植物激素，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)過程. 研究發(fā)現(xiàn)，GA3-氧化酶(gibberellin 3-oxidase, GA3ox)介導(dǎo)一個(gè)3β-羥基基團(tuán)到GA9和GA20上，生成有生物活性的GAs，GA1和GA4. 編碼赤霉素生物合成和代謝途徑的基因已經(jīng)在幾個(gè)植物中(包括擬南芥、水稻、南瓜和煙草)被克隆出來(lái)[1-3]，但蘋果中赤霉素生物合成和代謝途徑依然尚不清楚.

蘋果種子的液體胚乳通過一系列代謝，可以把甲羥戊酸轉(zhuǎn)化成GA[4]. 通過化學(xué)方法確定了在蘋果的未成熟種子中有GAs[5]. GA還參與了蘋果威塞克短枝型生長(zhǎng)習(xí)性的建立[6]. 但是蘋果中赤霉素生物合成途徑在分子生物學(xué)方面的進(jìn)展是蘋果基因的克隆[7]. Northern分析這個(gè)基因在未成熟的種子中表達(dá)量最高. 盛花后1~3個(gè)月，蘋果果實(shí)中的mRNA水平積累到非常高的水平，在早期和成熟后沒有檢測(cè)到有mRNA積累. 轉(zhuǎn)錄水平的增加與果實(shí)的快速增大是一致的. 這與Luchwill報(bào)道是一致的. Paris發(fā)現(xiàn)，果實(shí)的生長(zhǎng)速度通常與種子數(shù)一致，外施GA可以加快果實(shí)生長(zhǎng). 當(dāng)種子被去除時(shí)，GA也可以取代種子的作用[8]. Bulley從栽培品種綠袖(James Grieve x Golden Delicious)中克隆了兩個(gè)相似性很高的基因，分析顯示在發(fā)育中的胚乳具有很高的表達(dá)水平，花藥和雌蕊中表達(dá)很弱，種皮中沒有檢測(cè)到這個(gè)基因表達(dá). 酶分析顯示具有的活性，而只能把[14C]GA12轉(zhuǎn)化為GA15. 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法把干擾載體轉(zhuǎn)化到綠袖中得到了兩個(gè)矮化株系：一個(gè)單拷貝，一個(gè)多拷貝. 它們都表現(xiàn)為節(jié)間變短和減少，葉片變小. 外施GA3只能把節(jié)間的數(shù)目和長(zhǎng)度恢復(fù)到野生型，對(duì)葉片大小和下胚軸長(zhǎng)度沒有影響. 與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉片和莖尖的GA19增加，GA20和GA1減少[9].

本課題組從蘋果中克隆了，并通過一系列的實(shí)驗(yàn)證明了這是一個(gè)在花中表達(dá)的基因，且具有功能. 本文目的是驗(yàn)證蘋果GA氧化酶基因在植物中的功能，為進(jìn)一步在蘋果中應(yīng)用該基因搭建平臺(tái)，通過轉(zhuǎn)基因的方式實(shí)現(xiàn)蘋果的品種改良，為植物品種的改良提供新思路.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存，pCAMBIA1302 購(gòu)買自CAMBIA公司.

1.1.2植物材料

轉(zhuǎn)蘋果GA氧化酶基因煙草種子，開放閱讀框的引物.

1.1.3 MS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基(1L)：MS大量元素50mL，MS微量元素5mL，MS有機(jī)5mL，F(xiàn)e鹽5mL，蔗糖30g，pH5.8(固體培養(yǎng)基每升加8g瓊脂粉)，高壓滅菌；

MS大量元素：KNO338 000mg/L, NH4NO333 000mg/L, CaCl2·2H2O 8 800mg/L, MgSO4·7H2O 7 400mg/L, KH2PO43 400mg/L，配成20X母液；

MS微量元素：KI 166mg/L，H3BO31 240mg/L，MnSO4·4H2O 4 460mg/L，ZnSO4·7H2O 1 720mg/L，NaMO450mg/L，CuSO4·5H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 5mg/L，配成200X母液；

MS有機(jī)：肌醇 20 000mg/L，煙酸 100mg/L，鹽酸吡多醇 100mg/L，鹽酸硫胺素 100mg/L，甘氨酸 400mg/L，配成200X母液；

Fe鹽：FeSO4·7H2O 5 560mg/L，Na2EDTA·2H2O 7 460mg/L，配成200X母液.

1.1.4酶及試劑

羧芐鏈霉素(Cb)購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，潮霉素B(hpt)購(gòu)自索萊寶科技有限公司. 本論文中所用的各種限制性內(nèi)切酶、RNaseA、dNTP、Taq DNA Polymerase等購(gòu)自Takara生物工程公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1煙草種子的發(fā)芽和小苗種植

1)用次氯酸鈉消毒種子8分鐘后，用無(wú)菌水洗滌6次；2)把種子播在MS培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩周，觀察根長(zhǎng)和上胚軸變化；長(zhǎng)出真葉后將小苗轉(zhuǎn)移到有MS培養(yǎng)基的瓶子中繼續(xù)生長(zhǎng)；3)生長(zhǎng)一個(gè)月后，轉(zhuǎn)移到土里生長(zhǎng)，觀察表型.

1.2.2轉(zhuǎn)基因煙草植株在DNA水平上的檢測(cè)

用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA，用擴(kuò)增開放閱讀框的引物，以轉(zhuǎn)基因煙草DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)基因煙草植株.

1.2.2.1 DNA的提取

1) 取冷凍保存或新鮮的轉(zhuǎn)基因煙草，液氮下研磨，然后轉(zhuǎn)移到液氮預(yù)冷的1.5mL離心管中，加入500μL CTAB DNA提取緩沖液，65℃水浴1hr，每隔15min上下顛倒一次；

2) 從水浴中取出后，冷卻至室溫，加入500μL24:1的氯仿/異戊醇，上下輕柔顛倒混勻；

3) 12 500rpm離心15分鐘，取上清，加入500μL24:1的氯仿/異戊醇，上下輕柔顛倒混勻；

4) 如果中間層蛋白質(zhì)過多，重復(fù)步驟2；

5) 12 500rpm離心15分鐘，取上清，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，冰箱冷藏沉淀30分鐘；

6) 12 500rpm離心15分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，12 500rpm收集沉淀；

7) 干燥沉淀，用50μL含有RnaseA的TE溶解沉淀.

1.2.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段

1)在PCR管中加入適量緩沖液、模板DNA、dNTP，正向引物、反向引物和Taq酶，混合均勻后，短暫離心收集于管底；2)設(shè)定PCR程序，94℃，5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5min. 把樣品放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；3)擴(kuò)增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果.

表1 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系

1.2.3表型統(tǒng)計(jì)方法

幼根根長(zhǎng)的比較，取樣方法為：轉(zhuǎn)基因和野生型的煙草種子播在基本MS培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)2周，把在光照培養(yǎng)箱里生長(zhǎng)兩周的煙草種到土里，每周澆一次水. 待煙草苗長(zhǎng)大后，取完全展開的葉片，量取縱徑和橫徑的長(zhǎng)度. 開花時(shí)間是以看見花蕾為信號(hào)，比較轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的開花時(shí)間長(zhǎng)短. 待開花后，對(duì)整個(gè)植株的節(jié)間數(shù)進(jìn)行比較. 對(duì)于節(jié)間長(zhǎng)度的比較是開花后取從下往上數(shù)第三、五節(jié)間的長(zhǎng)度進(jìn)行比較. 對(duì)于葉面積、開花時(shí)間、節(jié)間數(shù)、節(jié)間長(zhǎng)度的比較則取10棵同一株系，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定

提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果見圖1，可以看出，正對(duì)照擴(kuò)出明亮的條帶，負(fù)對(duì)照沒有條帶，是符合正負(fù)對(duì)照要求的，3-13中，只有6、8、11和13擴(kuò)增出了和正對(duì)照一樣的條帶，說明他們是轉(zhuǎn)MdGA3ox1基因的煙草. 待6、8、11和13轉(zhuǎn)基因煙草結(jié)出種子后，進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn).

圖1 轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè)鑒定

注：M marker; 1正對(duì)照; 2負(fù)對(duì)照; 3-13轉(zhuǎn)基因煙草的PCR結(jié)果

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草幼苗與對(duì)照的表型比較

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的表型變化

2.2.1轉(zhuǎn)基因煙草幼苗期的表型變化

轉(zhuǎn)基因煙草種子經(jīng)次氯酸鈉消毒后種植在MS基本培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱里萌發(fā). 生長(zhǎng)兩周后移植到土里. 在土中生長(zhǎng)兩周后，觀察轉(zhuǎn)煙草與對(duì)照煙草(CK)的異同(圖2). 從圖2中可以看出，轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照相比沒有明顯的區(qū)別，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是在煙草中不是一個(gè)最關(guān)鍵的基因.

2.2.2轉(zhuǎn)基因煙草表型變化

從下圖3可以看出，轉(zhuǎn)基因的煙草株高增加(圖3a)，成熟葉片的面積明顯大于野生型對(duì)照(CK)，葉片狹長(zhǎng)，且葉片褶皺，葉柄縮短至幾乎沒有(圖3b).

ab

從表2中數(shù)據(jù)可以看出，與野生型相比，長(zhǎng)大后的轉(zhuǎn)煙草表現(xiàn)出赤霉素過量的表型，植株細(xì)長(zhǎng)，節(jié)間增長(zhǎng)，總體表現(xiàn)為開花提前，節(jié)間數(shù)減少，植株的高度減小，千粒重減少，節(jié)間長(zhǎng)度總體減小，葉片橫徑、縱徑均增大. 赤霉素在植物中的主要作用包括促進(jìn)植物開花和節(jié)間伸長(zhǎng)，這與轉(zhuǎn)基因煙草開花時(shí)間提前是相對(duì)應(yīng)的. 但是煙草葉片表型的變化不是過表達(dá)的典型性狀，這表明在煙草中，可能有未知的功能.

表2 MdGA3ox1轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)語(yǔ)

赤霉素對(duì)植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程都有作用，從種子萌發(fā)時(shí)期，種子吸漲激活赤霉素生物合成途徑中基因的表達(dá)，赤霉素的出現(xiàn)刺激α-淀粉酶的合成，開始消化淀粉為種子的萌發(fā)提供能量物質(zhì). 在整個(gè)生長(zhǎng)階段，赤霉素對(duì)莖稈的伸長(zhǎng)，葉片的擴(kuò)大都有重要的作用，缺乏赤霉素將造成植物矮稈的表型. 針對(duì)赤霉素的這種性質(zhì)，上世界50年代掀起了植物育種的“綠色革命”. 這也是植物分子育種中的一個(gè)重要切入點(diǎn). 蘋果屬于高大的喬木，在種植過程中的各個(gè)操作都較為困難. 矮化育種是蘋果育種的一個(gè)重要的方向.

根據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)，是赤霉素生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶基因. 本課題組從富士蘋果中克隆了，經(jīng)過體外生化實(shí)驗(yàn)、組織特異性表達(dá)等實(shí)驗(yàn)證明了它是一個(gè)有功能，主要在花中表達(dá)的基因. 為了進(jìn)一步驗(yàn)證在植物中的功能，我們構(gòu)建了的植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到煙草中. 通過對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草表型的觀察，推斷在蘋果中的功能.

本課題組分別對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的根長(zhǎng)、植株高度、植株節(jié)間數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)度、葉片大小、千粒重等指標(biāo)進(jìn)行了考察. 結(jié)果表明，對(duì)煙草的表型產(chǎn)生了很大的影響，既有赤霉素過量的典型表型，也有非典型的表型. 造成這些表型的原因可能有兩個(gè)，一是在煙草赤霉素生物合成途徑中，不是最關(guān)鍵的基因；二是基因的表達(dá)需要特定的的轉(zhuǎn)錄因子，在煙草中和蘋果中的啟動(dòng)子不同，結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子也不同，從而造成了表型的多樣化.

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Expression of Apple GA 3-oxidase 1() in Tobacco

ZHAO Huijun, YU Haizhong, WANG Haiyan, ZHU Wenquan

(School of Chemical Engineeringand Food Science, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China)

In recent years, gibberellin (GA) biosynthetic pathway has been improved in arabidopsis, rice and other species. But GA biosynthetic pathway is not yet clear in apple. In this paper,expression vector in plants was constructed and was transferred to tobacco by agrobacterium-mediated method to quickly verify gene function . The results showed that:tobacco phenotype had a great influence, both GA excess of typical phenotype, but also atypical phenotypes. The reason for this phenotype may be two, onenot the most critical gene in the tobacco gibberellin biosynthetic pathway; the second is the expression of the gene requires specific transcription factors, in tobacco and appleshas different promoters, and then binding different transcription factor, resulting in diverse phenotypes.

Gibberellins; Apple;; Tobacco

(責(zé)任編輯：徐 杰)

Q785

A

2095-4476(2015)02-0017-04

2014-11-10;

2015-01-06

趙慧君(1979— ), 女, 河南范縣人, 湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院講師, 博士