茄枝多糖的分離純化及成分分析

魏 杰，呂 磊，金莉莉，王秋雨*

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

茄枝多糖的分離純化及成分分析

魏 杰，呂 磊，金莉莉，王秋雨*

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

研究茄枝多糖的提取工藝和主要單糖組分。通過(guò)水提工藝，比較三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、Sevag、TCA與木瓜蛋白酶結(jié)合、Sevag與木瓜蛋白酶結(jié)合4 種脫除蛋白方法，使用DEAE-D22纖維素柱與Sephadex G-100柱層析精制獲得茄枝多糖ESP1-1，并對(duì)其進(jìn)行薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)與組分分析。木瓜蛋白酶與TCA法結(jié)合脫除蛋白效果最佳，蛋白清除率達(dá)到93%，多糖損失率為45.3%；TLC、HPLC檢測(cè)與分析證明ESP1-1具有多糖的理化性質(zhì)，主要由甘露糖、葡萄糖、果糖、木糖4 種單糖組成。研究結(jié)果可為茄枝多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

茄枝多糖；分離純化；單糖組成；高效液相色譜

多糖（polysaccharides）類(lèi)化合物一般無(wú)細(xì)胞毒性，是開(kāi)發(fā)抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)藥物和功能性食品的重要原料。活性多糖成分是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，利用天然多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑有著廣闊的應(yīng)用前景。其中以植物多糖，尤其 是中草藥中的水溶性多糖最為重要。植物多糖的生理藥用作用明顯，已經(jīng)有多種多糖產(chǎn)品應(yīng)用于保健、醫(yī)療方面，例如香菇多糖、靈芝多糖、蟲(chóng)草多糖等[1-3]。茄子在我國(guó)廣泛種植，茄枝產(chǎn)量巨大，尚無(wú)任何加工利用。關(guān)于茄枝多糖（eggplant stick polysaccharide，ESP）的分離純化、生物活性及藥用價(jià)值等方面的基礎(chǔ)研究尚未有報(bào)道。因茄枝來(lái)源廣泛、價(jià)值低廉、收集方便，本實(shí)驗(yàn)以茄枝為原料，研究ESP提取工藝、理化性質(zhì)、成分組成，為茄枝作為健康食品的原材料，以及ESP產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茄枝購(gòu)自沈陽(yáng)市場(chǎng)，經(jīng)過(guò)烘干、粉碎后，過(guò)40 目篩真空包裝保存?zhèn)溆谩?/p>

木瓜蛋白酶、濃硫酸、三氯乙酸、無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、苯酚、蒽酮、正丁醇、丙酮、氯仿、乙醚、異丙醇、磷酸、二苯胺、乙酸乙酯、乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、阿拉伯糖（標(biāo)準(zhǔn)品）、半乳糖（標(biāo)準(zhǔn)品）、甘露糖（標(biāo)準(zhǔn)品）、木糖（標(biāo)準(zhǔn)品）、葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品）、果糖（標(biāo)準(zhǔn)品）、碳酸鋇、苯胺、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、醋酸銨、乙腈（色譜級(jí)）、甲醇（色譜級(jí)）、G254硅膠板 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2489高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；DEAE-D22纖維素柱、Sephadex G-100 南寧東恒華道生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ESP含量測(cè)定的工作曲線(xiàn)

精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，加入體積分?jǐn)?shù)4%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，再加入5 mL濃硫酸，立即振蕩，沸水浴中煮沸15 min，取出冷卻至室溫，另以1 mL蒸餾水作空白對(duì)照，重復(fù)以上步驟，于400～520 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度[4]，確定最大吸收波長(zhǎng)為499 nm。

1.3.2 ESP提取工藝

參考相關(guān)研究結(jié)果[5-9]，通過(guò)對(duì)料液比（茄枝與水的比）1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90 5 個(gè)考察水平，提取溫度50、60、70、80、90 ℃ 5 個(gè)考察水平，提取時(shí)間1.5、2、2.5、3、3.5 h 5 個(gè)考察水平，提取次數(shù)1、2、3、4、5 次5 個(gè)水平進(jìn)行考察，進(jìn)行單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)的優(yōu)化，得到最佳的ESP水提醇沉提取工藝。

1.3.3 ESP脫蛋白

分別使用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法、Sevag法、TCA與木瓜蛋白酶解結(jié)合法、Sevag與木瓜蛋白酶解結(jié)合法對(duì)得到的ESP進(jìn)行脫蛋白處理[10-13]，重復(fù)6 次。用考馬斯亮藍(lán)染色法與苯酚-硫酸法分別測(cè)定4 種方法處理后的蛋白質(zhì)含量以及多糖含量。

1.3.4 ESP純化

ESP經(jīng)過(guò)水提醇沉、脫蛋白后，分別通過(guò)DEAE-D22纖維素柱層析、Sephadex G-100柱層析純化[14-18]，收集多糖主峰，得到ESP1-1，低溫濃縮后冷凍干燥。

1.3.5 ESP1-1的水解和薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）分析

取純化得到的ESP1-1樣品20 mg，加1 mol/L硫酸10 mL，置于100 ℃水解8 h，取出冷卻，加蒸餾水稀釋?zhuān)儆肂aCO3中和至中性，過(guò)濾離心取上清液低溫濃縮至5 mL得到ESP1-1單糖水解液，將半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品以及水解后的ESP1-1樣品在活化好的薄層硅膠板上分別點(diǎn)樣，經(jīng)展開(kāi)劑展開(kāi)，顯色劑顯色，觀察各樣點(diǎn)顏色與位置，初步判斷ESP1-1樣品的單糖組成[19-21]。

1.3.6 ESP1-1的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析[22-25]

將經(jīng)過(guò)柱前衍生處理，離心取上清液并過(guò)濾所得的單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液和ESP1-1水解樣品分別按照如下條件進(jìn)行洗脫分析；HPLC條件為：Waters色譜系統(tǒng)；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；色譜柱：Kromasil C18（150 m×4.6 mm，5 ?m）；柱溫35℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A乙腈，溶劑B醋酸銨pH 5.5；梯度模式：時(shí)間梯度，0 min→40 min→45 min→50 min，流動(dòng)相B洗脫梯度：95%→10%→95%→95%，從所得洗脫圖中可進(jìn)一步判斷ESP1-1樣品中單糖組分。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESP得率和脫蛋白

使用優(yōu)化的水提醇沉提取ESP方法，ESP的提取率達(dá)到2.87%。對(duì)比4 種脫蛋白方法（Sevag法、TCA法、木瓜蛋白酶法與Sevag法結(jié)合、木瓜蛋白酶法與TCA法結(jié)合），將得到的ESP進(jìn)行脫蛋白處理。由圖1可知，不同的脫蛋白方法對(duì)蛋白脫除效果和多糖損失率影響差異很大，處理次數(shù)的增加能夠提高蛋白脫除率，但是會(huì)伴隨大量多糖的損失。采用與酶法結(jié)合的方法，可以很好地提高蛋白脫出效果，同時(shí)減少多糖的損失率。木瓜蛋白酶法與TCA法結(jié)合使用后，在處理4 次時(shí)，蛋白清除率達(dá)到93%，多糖損失率為45.3%，與其他3 種方法相比，在提高蛋白清除率的情況下降低多糖損失率，效果相對(duì)較好。

圖1 4 種脫蛋白方法的蛋白清除率（A）、多糖損失率（B）比較Fig.1 Comparison of removal rates of protein and loss rates of polysaccharides with four deproteinization methods

2.2 ESP的DEAE-D22纖維素分離

將脫蛋白工藝后得到的ESP收集，凍干，獲得純化的ESP，將ESP過(guò)DEAE-D22纖維素柱進(jìn)行初級(jí)分離[18]。由圖2可知，經(jīng)過(guò)纖維素柱洗脫后得到3 個(gè)組分，按先后順序分別為ESP1、ESP2和ESP3。組分ESP1收集體積最大，約占90%。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)ESP1進(jìn)行了進(jìn)一步分離純化和組分分析。

圖2 DEAE-22纖維素層析柱洗脫曲線(xiàn)Fig.2 Elution curve of polysaccharide on DEAE-22 cellulose column

2.3 ESP的Sephadex G-100分離

將ESP1濃縮凍干，得到淡黃色粉末，經(jīng)過(guò)Sephadex G-100進(jìn)一步分離，得到一個(gè)單獨(dú)的洗脫峰，合并收集洗脫峰，濃縮，凍干得到精制ESP1-1，將收集的ESP1-1按照同樣的條件再進(jìn)行一次Sephadex G-100分離處理，如圖3所示，ESP1-1基本是成分單一的多糖。

圖3 Sephadex G-100層析柱洗脫曲線(xiàn)Fig.3 Elution curve of polysaccharide on Sephadex G-100 column

2.4 ESP的TLC分析

圖4 ESP的TLCC結(jié)果Fig.4 TLC results of polysaccharides from eggplant branches

由圖4可知，根據(jù)ESP1-1在TLC結(jié)果的位置可以初步判斷ESP含有甘露糖和葡萄糖。

2.5 ESP的HPLC分析

圖5 6 種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）及ESP1-1（B） HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of mixture of six monosaccharide standards and ESP1-1

由圖5可知，ESP1-1的單糖組成有葡萄糖、甘露糖、木糖和果糖。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)ESP的提取工藝和單糖成分進(jìn)行研究與分析。按照前期獲得的水提醇沉工藝提取茄枝粗多糖，以蛋白清除率、多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇酶法與TCA法相結(jié)合的方法脫除蛋白，經(jīng)過(guò)DEAE-D22纖維素柱與Sephadex G-100柱層析進(jìn)行分級(jí)分離，收集主要洗脫峰，合并洗脫液，濃縮、透析、凍干得到精制的純ESP1-1。ESP1-1的TLC、HPLC檢測(cè)與組分分析，證明ESP1-1主要由甘露糖、葡萄糖、果糖、木糖4 種單糖組成。本研究結(jié)果可為ESP的 開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)支持。

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Extraction and Monosaccharide Composition Analysis of Polysaccharides from Eggplant B ranches

WEI Jie, L? Lei, JIN Lili, WANG Qiuyu*
(School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Objective: To study the extraction and monosaccharide composition of polysaccharides from eggplant bra nches. Methods: The aqueous extract of eggplant branches was deprotenized by four different methods, trichloroacetic acid (TCA), Sevag, combination of TCA with papain, combination of Sevag with papa in. Further purification was conducted by DEAE-D22 cellulose and Sephadex G-100 gel column chromatograph sequentially. The obtained polysaccharide was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Results: A polysaccharide, named as ESP-1, was obtained. Meanwhile, the best deproteinization method was achieved by the combined use of TCA and papain, resulting in a deproteinization rate of 93% and a polysaccharide loss of 45.3%. By TLC and HPLC, the polysaccharide was confirmed based on its physicochemical properties. In addition, ESP1-1 was mainly composed of mannose, glucose, fructose and xylose.

polysaccharide from eggplant branches; purification; monosaccharide composition; high performance liquid chromatography (HPLC)

Q78

A

1002-6630（2015）04-0168-04

10.7506/spkx1002-6630-201504032

2014-07-02

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F12-277-1-40）；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目（L2013007）

魏杰（1977—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锕こ?。E-mail：weijie@lnu.edu.cn

*通信作者：王秋雨（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：qiuyuwang@lnu.edu.cn