江宇，韓鐘霖，曹克將，汪道武

基礎(chǔ)與實驗研究

酒精性心肌病小鼠心電圖校正QT間期延長的電生理機(jī)制探討*

江宇，韓鐘霖，曹克將，汪道武

目的：通過建立酒精性心肌病小鼠動物模型，研究酒精性心肌病小鼠校正QT間期（QTc）延長的電生理機(jī)制。

方法：將40只C57 BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組，酒精組（n=25）和對照組（n=15）。酒精組通過長期飲酒和灌胃建立小鼠酒精性心肌病模型，因造模和麻醉過程中死亡12只小鼠，最終納入13只小鼠，對照組麻醉過程中死亡3只小鼠，最終納入12只。使用染色和電鏡驗證酒精性心肌病模型，用小動物心電圖測量小鼠心電圖相關(guān)指標(biāo)，通過酶解法將小鼠心室肌細(xì)胞進(jìn)行急性分離，最后使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對細(xì)胞動作電位以及各種離子通道進(jìn)行電生理學(xué)檢測，并進(jìn)行通道相關(guān)動力學(xué)急性檢測。

結(jié)果：5個月后，酒精組小鼠平均左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）值為（39.06±1.511）%，而對照組小鼠為（61.18±2.56）%。小鼠心電圖檢查顯示，酒精組平均QTc較對照組明顯延長[（106.43±5.91）ms vs （85.64±6.35）ms，P＜0.05]。全細(xì)胞膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠心肌細(xì)胞動作電位時程延長，心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極至90%所需時間（APD90）為（37.62±3.53）ms，對照組小鼠心肌細(xì)胞APD90為（25.77±3.41）ms。膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠L型鈣電流失活延遲，其窗口電流面積增大。

結(jié)論：長期大量飲酒可導(dǎo)致心室肌鈣通道失活延遲，從而延長心室肌細(xì)胞動作電位。這是酒精性心肌病小鼠心電圖QTc延長的原因之一。

酒精性心肌病；校正QT間期；膜片鉗實驗；動作電位；L型鈣電流

Methods: A total of 40 C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups: Alcoholic group, n=25, the ACM model was established by long term alcohol drinking and intragastric alcohol administration, 12 mice died during modeling and anesthesia and 13 mice were enrolled for study. Control group, n=15, the mice were fed by normal diet, 3 died during anesthesia and 12 were enrolled for study. All animals were treated for 5 months. The pathological changes of ACM were examined by electric microscope, QT interval was measured by ECG, the electrophysiology of cell action potential duration and ion channels were detected by whole cell patch-clamp techniques.

Results: Alcohol group showed decreased left ventricle ejection fraction (LVEF) than Control group (39.06 ± 1.511) % vs (61.18 ± 2.56) %, prolonged QT interval (106.43 ± 5.91) ms vs (85.64 ± 6.35) ms, P＜0.05, and extended action potential duration APD90(37.62 ± 3.53) ms vs (25.77 ± 3.41) ms. Alcohol group also presented delayed voltage-dependent inactivation of L-type Ca2+channel and increased window current area.

Conclusion: Long term alcohol drinking may cause extended inactivation of myocardium Ca2+channel, prolong the action potential duration, which is one of the mechanisms for prolonged QT interval of ACM in experimental mice.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:374.)

眾所周知，校正QT間期（QTc）延長和離散增加與心律失常密切相關(guān)，QTc延長也是酒精性心臟病猝死患者中常見的現(xiàn)象之一[1-3]。這部分患者發(fā)生QTc延長的概率為22%～46.9%[4]。QT間期與動作電位時程（APD）的變化與心肌細(xì)胞離子通道功能相關(guān)，目前已有研究證明多種動物心肌細(xì)胞在急性酒精作用下可影響細(xì)胞APD。Williams等[5]發(fā)現(xiàn)，5分鐘的酒精暴露即可下調(diào)家犬心臟蒲肯野纖維的APD。然而，相關(guān)研究多側(cè)重于酒精對心肌離子通道的急性變化，這種變化并不能完全代表臨床長期飲酒導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)及電生理重構(gòu)的變化。由于目前關(guān)于慢性飲酒對心肌電生理的影響的研究尚不充分，因此本研究旨在慢性酒精性心臟病小鼠的基礎(chǔ)上，觀察并探討小鼠QTc變化的機(jī)制，為今后的臨床研究提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

酒精性心肌病小鼠模型的建立：2013-03至2014-09使用6周齡立特艾比拉特洛波C57BL/6清潔級小鼠[由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2012-0004]40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分組，酒精組25只，對照組15只，兩組小鼠平均體重?zé)o明顯差異。參考Wei Liu等[6]大鼠酒精性心肌病造模方法，酒精組依次給予濃度為5%、10%酒精自由飲一周后，在10%酒精自由飲的基礎(chǔ)上，以30%酒精灌胃0.2 ml/d，持續(xù)5個月造模（含酒精飲用水為唯一水源）。對照組以同等熱量的葡萄糖水灌胃。

超聲心動圖結(jié)構(gòu)及功能測定：在造模和麻醉過程中，酒精組死亡12只小鼠，最終剩余13只；對照組死亡3只，最終僅剩12只。使用小動物超聲成像系統(tǒng)（Vevo770，Visual Sonics，加拿大）進(jìn)行二維超聲心動圖檢測，超聲探頭為RMV70型。計量資料連續(xù)測量5個心動周期取平均值。測量指標(biāo)包括室間隔厚度（IVS）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室后壁收縮厚度（LVPW）。

心電圖測量：造模5個月后隨機(jī)從酒精組和對照組各取7只小鼠進(jìn)行心電圖測量（酒精組小鼠麻醉過程中死亡1只，僅剩6只），接通多道生物信號采集與處理系統(tǒng)（RM6240B，成都儀器廠，中國），用0.1 ml 10%的水合氯醛麻醉小鼠，3～5 min待小鼠安靜后，取小鼠仰位，電極連線分為紅色（E）右上肢、黑色（EB）右下肢、綠色（HB）左下肢（Ⅱ?qū)В?，將針電極分別刺入其四肢皮下，記錄Ⅱ?qū)?lián)的心電圖。

心肌病理形態(tài)學(xué)、電鏡和心肌膠原纖維染色：造模5個月后用斷頸術(shù)處死3只小鼠，取出心臟，用4%甲醛固定，石蠟包埋，取左心室冠狀面制備3 mm薄切片，蘇木精-伊紅（HE）染色和馬松（masson）染色后顯微鏡下觀察形態(tài)變化。另取1 mm×1 mm左右的組織，固定、脫水、包埋、切片、染色進(jìn)行透射電鏡（JEOL-1010，日本電子，日本）觀察。

單個心室肌細(xì)胞的分離：酒精組和對照組各選用造模5個月的4只小鼠以1000 U/kg肝素皮下注射，斷頸后，快速取出心臟，置于Langendorff灌流系統(tǒng)中，在37℃恒溫下進(jìn)行主動脈逆行灌流，流速3 ml/min。用臺氏液[正常臺氏液成分（單位mmol/L）：氯化鈉140；氯化鉀5.4；氯化鈣1.8；氯化鎂0.5；4-羥乙基哌嗪乙磺酸5.0；葡萄糖5.5；磷酸二氫鈉0.4，酸堿度（pH）用氫氧化鈉調(diào)至7.40]灌流1 min排除殘留血液后，換無鈣臺氏液[為正常臺氏液中不加鈣離子]灌流5 min排出液體中鈣離子，最后用含有0.05%膠原酶Ⅱ（Type 2，Worthington，美國）液體灌流12～15 min。取下心臟，將心室肌剪碎、吹打成單個心室肌細(xì)胞，自然沉淀，吸取上清液，用上述不含膠原酶的液體在室溫下孵育10 min、在KB液（單位mmol/L：氫氧化鉀70，氯化鉀40，磷酸二氫鉀20，L-谷氨酸50，?；撬?0，乙二醇雙四乙酸0.5，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖10，用氫氧化鉀將pH調(diào)節(jié)至7.3）中孵育2 h后，選擇其中紋理清晰、表面光滑的單個心室肌細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實驗。

小鼠心室肌細(xì)胞膜片鉗實驗：全細(xì)胞記錄單個心室肌細(xì)胞動作電位和鈉電流、L型鈣電流以及瞬

時外向鉀通道電流。將細(xì)胞懸液滴于三維倒置顯微鏡（IX50，OLYMPUS，日本）工作臺上的灌流槽內(nèi)，待細(xì)胞黏附于槽底后，用細(xì)胞外液灌流，灌流速度l ml/min。玻璃微電極（1.4 mm，南京泉水電生理儀器廠，中國）用玻璃微電極拉制儀（P-1000 Model，Sutter Instrument，美國）拉制，電極灌沖內(nèi)液后的電阻是1～3 MΩ，電極與膜片鉗放大器（Axopatch 200B，Axon Instrument，美國） 相連，當(dāng)電極尖端與細(xì)胞表面接觸后，以持續(xù)負(fù)壓吸引，使電極尖端與細(xì)胞表面形成高阻抗（1 G以上）封接，再以微小負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，計算機(jī)補(bǔ)償快速膜電容，形成全細(xì)胞記錄。在全細(xì)胞電流鉗狀態(tài)下記錄到心室肌細(xì)胞的靜息電位，然后給予脈寬3 ms、電流強(qiáng)度200～400 pA的刺激，即可誘發(fā)小鼠心室肌細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生。測量心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極至90%所需時間（APD90）；在全細(xì)胞電壓鉗狀態(tài)下，用細(xì)胞外液灌流5 min，分別記錄鈉電流、L型鈣電流以及瞬時外向鉀電流及相關(guān)動力學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果

心電圖結(jié)果：通過對小鼠Ⅱ?qū)?lián)的觀察，發(fā)現(xiàn)酒精組（n=6）小鼠的心率、PR間期、RR間期和QRS間期與對照組（n=7）沒有明顯差異（P＞0.05），QTc延長有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表1

心功能觀察結(jié)果：5個月后，酒精組小鼠（n=13）LVEF和LVFS值均低于對照組（n=12），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。表2

表1 兩組小鼠的心電圖比較分析（

表1 兩組小鼠的心電圖比較分析（

注：與對照組比較*P＜0.05

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表2 兩組小鼠心功能指標(biāo)檢測結(jié)果

表2 兩組小鼠心功能指標(biāo)檢測結(jié)果

注：與對照組比較*P＜0.05。LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù) LVPWd：左心室后壁厚度 IVS：室間隔厚度LVFS：左心室短軸縮短率

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心肌組織電鏡、病理和心肌膠原染色結(jié)果：通過HE染色發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠心肌細(xì)胞老化、縮小，肌纖維斷裂不規(guī)則（圖1B，箭頭標(biāo)注），而對照組心肌細(xì)胞飽滿，肌纖維排列整齊（圖1A），兩組masson染色無明顯差異（圖1D、1C）。在電鏡下，酒精組出現(xiàn)明顯可以看到部分肌絲斷裂，肌絲間可見潤盤縫隙連接區(qū)斷裂，致密斑消失，脂滴生成（圖1F，箭頭標(biāo)注）；而對照組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)有輕度凝集現(xiàn)象，肌細(xì)胞各帶結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞器豐富（圖1E）。圖1

圖1 兩組小鼠心肌組織目鏡病理和電鏡結(jié)果

膜片鉗實驗結(jié)果：酒精組小鼠心肌細(xì)胞（n=9）APD90較對照組（n=13）明顯延長[（37.62±3.53）ms vs（25.77±3.41）ms]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖2

離子通道電流及其動力學(xué)測量發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠的鈣通道電流密度絕對值較對照組有所減少[（-7.49±0.56）pA/pF

vs （-10.31±0.60）pA/pF，P＜0.05）]（圖3），但酒精組失活動力學(xué)檢測下半失活電壓向負(fù)極方向移動，提示較對照組明顯失活延遲[（-31.78±1.44）mV vs （-39.55 ± 1.26）mV，P＜0.05]，而激活動力學(xué)檢測下兩組無明顯差異。表3

圖2 兩組小鼠心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極至90%所需時間比較（

圖3 兩組小鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流電流電壓曲線的比較

表3 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈣電流動力學(xué)指標(biāo)比較

表3 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈣電流動力學(xué)指標(biāo)比較

注：與對照組比較*P＜0.05； V1/2：半失活電位 K：斜率

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實驗發(fā)現(xiàn)，鈉電流與動作電位的誘發(fā)及心電傳導(dǎo)有關(guān)。酒精組小鼠心肌細(xì)胞（n=17）和對照組（n=13）的鈉電流密度分別為[（36.00±2.41）pA/ pF vs（36.66±1.63）pA/pF] ，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖4），激活和失活動力學(xué)中斜率K酒精組均小于對照組，有微小差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

圖4 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈉電流電流電壓曲線的比較

表4 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈉電流動力學(xué)指標(biāo)比較

表4 兩組小鼠心肌細(xì)胞鈉電流動力學(xué)指標(biāo)比較

注：與對照組比較*P＜0.05。余注見表3

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瞬時外向鉀電流是小鼠心室肌細(xì)胞復(fù)極的主要外向電流。酒精組小鼠心室肌細(xì)胞（n=9）鉀電流密度與對照組（n=9）無明顯差異[（44.45±6.45）pA/ pF vs（48.93±8.74）pA/pF，P＞0.05]，且兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀通道動力學(xué)也無明顯差異（P＞0.05）。圖5、表5

圖5 兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流電流電壓曲線的比較

表5 兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀通道動力學(xué)比較

表5 兩組小鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀通道動力學(xué)比較

注：V1/2和K注釋見表3

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3 討論

飲酒是常見的猝死原因[7]，長期大量飲酒可使心臟擴(kuò)大，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，心肌收縮功能減退，左心室射血分?jǐn)?shù)降低[8]，且可增加心源性猝死風(fēng)險[9]。本研究中酒精組小鼠通過5個月的酒精飼養(yǎng)和灌胃，出現(xiàn)LVEF和LVFS降低等心功能下降等情況；病理檢查發(fā)現(xiàn)酒精組小鼠心肌細(xì)胞肌纖維斷裂不規(guī)則，電鏡下肌絲斷裂，潤盤縫隙連接區(qū)斷裂，致密斑消失，脂滴生成；同時酒精組小鼠心電圖QTc顯著延長；這些特征與相關(guān)報道相符[6,10,11]。在全細(xì)胞膜片鉗實驗中，酒精組小鼠APD90延長，鈣通道失活延遲，鈣通道窗口電流增大。雖然酒精組小鼠的鈣電流密度減小，但是其失活動力學(xué)顯著延遲，鈣通道窗口電流增大，提示鈣通道功能部分上調(diào)。此外，鈣通道功能的上調(diào)是8型長QT間期綜合征患者QTc延長的原因之一，Boczek等[12]的研究發(fā)現(xiàn)突變的鈣通道雖然電流減小，但是開放提前，功能上調(diào)，最終的結(jié)果是窗口電流增大，這就表明鈣通道在激活和失活的交替過程中，有更多的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致復(fù)極時所需鉀離子增多。本研究發(fā)現(xiàn)鈣通道電壓依賴性失活延遲而電壓依賴性激活變化不明顯，綜合起來可導(dǎo)致窗口電流增大，這與之前的研究結(jié)果有類似之處，同時我們還發(fā)現(xiàn)瞬時外向鉀電流密度無明顯差異；綜合來看，以上因素可能是動作電位時程延長的主要原因之一。而且鈣通道窗口電流增大還可引起早期后除極，這也是導(dǎo)致心律失常發(fā)生的重要機(jī)制之一[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，在急性酒精浸潤情況下，細(xì)胞動作電位縮短，鈉電流、鉀電流、鈣電流都有一定程度減小，但這反映的是酒精的急性作用，并不能說明在長期酒精作用下患者心臟電生理是否發(fā)生改變。本研究的結(jié)果提示鈉電流可能并不是導(dǎo)致酒精性心肌病心電活動異常的主要原因。我們發(fā)現(xiàn)長期飲酒使鈣通道的失活延遲，開放時間相對延長，導(dǎo)致鈣通道窗口電流增大，從而使動作電位時程延長，最終促使小鼠QTc延長，而QTc延長是引起心室復(fù)極異常的重要原因，后者為猝死的心電基質(zhì)[15]。這為酒精性心肌病患者猝死發(fā)生率升高提供了新的電生理學(xué)理論依據(jù)。

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The Electrophysiological Mechanism of QT Prolongation in Experimental Mice With Alcoholic Cardiomyopathy

JIANG Yu, HAN Zhong-lin, CAO Ke-jiang, WANG Dao-wu.
Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing (210029), Jiangsu, China

Objective: To investigate the electrophysiological mechanism of QT prolongation in experimental mice with alcoholic cardiomyopathy (ACM).

Alcoholic cardiomyopathy; QT interval; Patch clamp; Action potential duration, L-type calcium current

2014-12-19）

（編輯：朱柳媛）

國家自然科學(xué)基金面上項目（81170159）；江蘇省六大人才高峰資助項目（2012-WS-018）

210029 江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科

江宇 碩士研究生 主要從事心臟起搏與電生理相關(guān)研究 Email: 328450715@qq.com 通訊作者：汪道武 Email: david37212@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2015）04-0374-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.04.018